桃是我國重要的落葉果樹,截止2007年,栽培面積已達71.28萬hm2,總產量803.2萬t,栽培面積和產量均居世界首位①,在我國果樹生產中占有十分重要的地位。根癌病主要危害桃樹的主根、側根及主干基部,被侵染部位細胞惡性分裂而形成腫瘤,導致輸導組織紊亂,養分水分運輸受阻,植株生長緩慢,葉片黃化,產量降低,果實品質下降,甚至整株死亡,對桃樹苗木及桃果生產危害十分嚴重,是重要的檢疫病害。根癌菌寄主范圍廣泛,除木本植物以外,亦可侵染草本植物,許多林地、果園乃至種植糧食作物的耕地土壤均有分布,在這些土地上繁育桃苗或建立桃園都有可能發生嚴重的根癌病危害。
桃 樹 根 癌 病 的 病 原 菌 為 發 根 土 壤 桿 菌\\(Agrobacterium rhizogenes\\)和根癌土壤桿菌\\(A.tumefaciens\\),可通過灌溉水、果園耕作機械和苗木調運遠距離傳播。該病原菌一旦侵入植物體內就很難被殺死,即便病原菌被徹底消滅,被侵染植物亦會形成癌腫病導致嚴重危害。因此,根癌病的防治一直是一個難以解決的問題。
植物檢疫是防止根癌病跨省傳播的主要途徑,但由于我國果樹苗木生產經營過于分散,檢疫環節也不能有效防止根癌病的傳播。在生產上,用硫酸銅溶液、石灰水或生防菌蘸根是防止根癌病發生的常用方法,但銅離子容易導致桃樹的生理病害,生防菌的應用成本較高。切除腫瘤是迄今為止果樹根癌病治療的唯一有效方法,但復發率很高,必須輔以傷口涂抹硫酸銅、石硫合劑、福美砷和生防菌等提高療效。此法不僅工作量大,而且銅離子會導致環境污染。因此,選育抗根癌病砧木品種才是桃樹根癌病防治的既經濟高效又環境友好的途徑與方法,而要選育抗病型砧木品種,就必須對桃樹砧木種質資源樹種進行抗根癌病性能評價,以找到優良抗型植株。
山桃\\(Prunus davidiana\\(Carr.\\)Franch\\)廣泛分布于我國山東、山西、河北、河南、陜西、甘肅、四川及云南等省區,是我國傳統的主要桃樹砧木樹種之一。山桃耐旱性、抗寒性強,以其為砧木嫁接的桃樹樹勢中庸健壯、結果早、產量高,所結果實口味純正,具有獨特的開發利用潛質。本研究旨在探明山桃的抗根癌病種質資源價值,為培育抗根癌病桃樹砧木優良品種提供部分科學依據。
1 材料與方法
本研究于2012—2013年在中國農業大學上莊實驗站8號日光溫室內進行。
1.1 試驗材料
一年生山桃實生苗250株,苗干粗3mm以上。
種子購于陜西省渭南市。沙藏90d后播于12cm×12cm的營養缽內?；|由田園土、蛭石、草炭體積比1∶1∶1混合而成,經121 ℃高壓滅菌20min。
缽苗在日光溫室內養護。
本實驗室從感染根癌病的桃樹根部癭瘤上分離、鑒定和保存的Ap10\\(發根土壤桿菌\\)和Ap2\\(根癌土壤桿菌\\),分別配成108cfu/mL的懸浮液。用以鑒定菌株致病性的向日葵苗20株,株高約15cm,穴盤培養,栽培基質同山桃。
1.2 山桃接種
將供試植株依次編號、掛牌、登記。
120株接種發根土壤桿菌,120株接種根癌土壤桿菌,另10株接種無菌水為對照。每株接種3個位點,相鄰位點距離1.5cm左右。接種前先用70%酒精擦拭接種部位,再用一次性7號注射器注入1滴菌液。接種深度以針頭觸及木質部為準。接種后用蘸有菌液的脫脂棉包扎傷口保濕1周。接種后的山桃苗在溫室內養護,室內溫度25~35℃。
1.3 病原菌致病性檢測
取10株向日葵苗苗莖針刺接種發根土壤桿菌,另10株接種根癌土壤桿菌,方法同1.2。接種后10d,接種部位全部形成瘤狀突起。
1.4 抗性評價
接種后70d,以株為單位用游標卡尺測量腫瘤+枝條直徑和腫瘤上方枝條的直徑,兩者之差即為瘤莖大小。
根據單株最大瘤莖分別評價山桃對發根土壤桿菌和根癌土壤 桿菌 的群體抗性和 群 體 抗 性 分 離情況。病級劃分標準:根據株最大瘤徑大小,將供試植株的發病輕重分為6個等級。0級未發病,接種部位突起<1.0mm,與對照無明顯差異;1級瘤徑1.0~3.0mm;2級瘤徑3.1~5.0mm;3級瘤徑5.1~7.0 mm;4級瘤徑7.1~10.0 mm;5級瘤徑>10.0mm。
群體抗性評價標準:根據病情指數大小,將山桃對根癌病群體抗性分為6個等級。免疫,病情指數為0;高度抗病,0<病情指數≤20;中度抗病,20<病情指數≤40;低度抗病,40<病情指數≤60;感病,60<病情指數≤80;易感病,病情指數>80。
病情指數=∑\\(病級×同病級株數\\)最高病級×調查總株數×100群體抗性分離情況分析:根據株最大瘤徑大小和個體抗性分級標準,逐一確定供試植株的個體抗性,再根據個體抗性評價結果統計分析山桃實生群體對2種根癌菌的抗性分離情況。
個體抗性評價標準:根據株最大瘤徑大小將個體抗性分為6個等級。免疫,未發病,接種部位突起小于1mm,與對照無明顯差異;高度抗病,瘤莖1.0~3.0mm;中度抗病,瘤莖3.1~5.0mm;低度抗病,瘤 莖5.1~7.0 mm;感 病,瘤 莖7.1~10.0mm;易感病,瘤莖≥10.0mm。
2 結果與分析
向日葵苗接種鑒定結果表明,本次評價所使用的2個菌株Ap10和Ap2具有良好的致病性;與接種的240株山桃苗一起養護的10株對照山桃苗均未發病,表明本次試驗未受其他根癌病菌的污染。
2.1 山桃對發根土壤桿菌的抗性
試驗結果顯示\\(表1\\),接種后70d,120株山桃實生苗的株最大瘤莖為0~20.3mm,0、1、2、3、4和5級病株數分別為25、6、15、14、24和36株,病情指數為59,根據抗性評價標準判定其為低抗發根土壤桿菌型樹種。個體抗性評價結果表明,實生山桃對發根土壤桿菌的抗性存在廣泛的株間分離現象,其中存在免疫、高抗、中抗、低抗、感病和易感病全部6種抗性類型,120株供試植株中有免疫、高抗、中抗、低抗、感病和易感病型25、6、15、14、24和36株,分別占群體總數的20.8%、5.0%、12.5%、11.7%、20.0%和30.0%\\(表2\\)?！颈?】
2.2 山桃對根癌土壤桿菌的抗性
試驗結果顯示\\(表3\\),接種后70d,120株山桃實生苗的株最大瘤莖為0~5.3mm,0、1、2和3級病株 數 分 別 為42、67、10和1株,未 出 現4級和5級病株,病情指數為15,根據抗性評價標準判定其為高 抗根癌土壤桿菌 型 樹 種。個 體 抗性評價結果表明,實生山桃對根癌土壤桿菌的抗性存在顯著的株間 分離現象,其中存在免疫、高抗、中抗和低抗4種抗性類型,120株供試植株中有免疫、高抗、中抗和低抗型42、67、10和1株,分別 占 群 體 總 數 的35.0%、55.8%、8.4%和0.8%\\(表4\\)?！颈?】
3 討論
一套合理完善的評價體系是進行抗根癌病評價工作的前提。該體系包括以下幾個方面:
1\\)首先是接種用的根癌菌要有良好的致病性。由于根癌菌的致病性是由其體內致癌質粒上的致癌基因,而非染色體上的基因所決定,在繁殖過程中,有相當一部分的后代體內會失去致病質粒而失去致病性,隨著繁殖代數的增加,菌群中致病性個體所占比例越來越低,群體致病性越來越弱,乃至消失。因此,在對植物抗病性評價或鑒定接種前,必須對病原菌進行致病性鑒定。
2\\)其次是評價內容、評價材料與群體大小的確定。多數研究者只評價某種植物對根癌菌的群體抗性,而忽視了個體抗性和群體抗性分離情況,這樣評價的結果會導致研究成果的理論與應用價值均大幅度降低;評價某一種植物的抗性要選擇有一定代表性的實生群體,而不是來自某一個或幾個特殊的植株,亦不可是無性繁殖的群體,以保證評價結果的客觀性;被評價植物群體數量大小,是關乎評價結果客觀性的另一重要因素,群體數量越小,評價結果的客觀性越差,數量越大,則評價結果的客觀性越好;但群體數量過大,則評價工作量越大,成本也越高。根據多年多樹種抗性評價工作,認為群體數量以100~150株為宜。
3\\)選擇合適的接種方法以及接種后的養護環境與養護時間。常見的接種方法有刀片劃傷苗莖,然后用棉花蘸取菌液包裹傷口,或者人為在植株根部造成傷口后用菌液澆灌。但前者操作復雜,傷口長度、深淺、接種量不易控制,后者不利于調查和觀察腫瘤生長狀態。相對來說,針刺接種嫩梢的方法操作簡單、腫瘤形狀較規則,便于調查。而且新稍對根癌菌侵染比根部更敏感,能更好地反應植物對根癌病的抗性。接種后的空氣濕度和溫度對病原菌的侵染和癌瘤的形成與發育影響很大。研究表明,在較高的適度條件下,根癌土壤桿菌和發根土壤桿菌在30min內即可侵染毛桃和山桃。因此,接種后保濕5~24h已足夠保證病原菌的正常侵染,在高溫季節用棉球外包保鮮膜保濕一周,有時會導致其他病原菌侵染而影響評價結果的客觀性。此外,即使在適宜的環境條件下,腫瘤的發育也需要一定的時間,隨著時間的推移,抗性不同的植株接種部位腫瘤大小的差異逐漸加大,只有接種后的時間達到一定的長度后,被評價群體內的個體抗性差異才能充分表現出來。因此,接種后養護時間過短,則會導致評價結果的客觀性降低,接種后的養護時間以60~70d為宜。
4\\)最后是病級劃分指標與抗性等級的確定。植物抗根癌病性能評價中首先要確定病級和個體抗性劃分指標,以往的研究常采用接種發病率、腫瘤數量、腫瘤大小或質量、平均瘤徑等。以株最大瘤徑為病級和個體抗性劃分指標具有簡單、客觀、可操作性強等特點。前人在評價中國野生葡萄對根癌病的抗性時把抗病性分為4個等級:高抗、中抗、中感、高感;在此基礎上有研究將評價標準拓展到免疫、高抗、中抗、感病、易感病5個等級;很顯然,這種劃分還有一定的缺陷。因此,本研究沿用了免疫、高抗、中抗、低 抗、感 病 與 易 感 病 六 級 劃 分方案。
4 結論
山桃低抗發根土壤桿菌、高抗根癌土壤桿菌,其實生群體對2種根癌菌的抗性均存在廣泛的株間分離現象。其對抗發根土壤桿菌的抗性分離為免疫、高抗、中抗、低抗、感病和易感病6種類型,每種抗型植株分別 占群體總 數 的20.8%、5.0%、12.5%、11.7%、20.0%和30.0%;其對根癌土壤桿菌的抗性分離為免疫、高抗、中抗和低抗4種類型,分別占群體總數的35.0%、55.8%、8.4%和0.8%。山桃中存在大量發根土壤桿菌和根癌土壤桿菌免疫型植株,是極優異的抗根癌病種質和基因資源樹種。
參考文獻
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