植物寄生線蟲是重要的植物病原物之一，分布廣，種類多，主要包括根結線蟲、松材線蟲、大豆孢囊線蟲、莖線蟲及香蕉穿孔線蟲等，據不完全統計，全世界每年因寄生線蟲造成的農作物經濟損失約在 1 000 億美元以上。長期以來，廣泛使用化學藥劑對線蟲病害進行防治雖取得較好的效果，但存在高毒、高殘留的弊端。近年來，隨著人們環保意識的增強和高毒、高殘留農藥的禁用，生物防治日益受到重視，并且被認為是最具發展前景的防治手段。為此，國內外學者開展了大量的研究工作，對植物寄生線蟲有生防潛力的微生物已成為研究的熱點。目前從土壤微生物中分離出的被應用到生產實踐中的生防菌有阿維鏈霉菌、芽孢桿菌、淡紫擬青霉等，且由阿維鏈霉菌開發的高效、低毒、廣譜的阿維菌素已進行商業化生產，被廣泛應用，發展前景廣闊。但近年來從土壤微生物中獲得對植物寄生線蟲有生防作用菌株的比例逐年下降，而從另一類較新的微生物類群——植物內生菌中分離出對植物寄生線蟲有生防作用菌株的研究受到人們的重視，成為分離獲得植物寄生線蟲生防菌的重要來源。因此，本研究是從植物內生菌的分布和種類、分離培養、活性篩選、活性物質成分以及防治植物寄生線蟲的作用機理幾方面進行綜述，并對植物內生菌防治植物寄生線蟲的相關問題及發展趨勢進行了探討，以期為深入開展相關研究提供參考。
1、分布和種類
植物內生菌（Endophyte）指那些在生活史的某一階段或者全部階段生活在健康植物組織或器官內的真菌、細菌或放線菌，被感染的宿主植物不表現外在癥狀。在目前研究過的所有植物中均發現內生菌，它們存在于植物的根、莖、葉、花、果實等各個部位。目前已報道的內生細菌超過 129種（隸屬于 54 個屬），內生真菌達到 171 個屬，內生放線菌主要為鏈霉菌（Streptomyces）、鏈輪絲菌（Streptoverticillum）、游動放線菌（Antinoplanes）、諾卡氏菌（Nocardia）、小單胞菌（Micromonospora）。
可見，植物內生菌在植物體內的分布具有普遍性和多樣性的特點，這為開展植物內生菌防治植物寄生線蟲的研究提供了有利資源。目前已發現的具有防治植物寄生線蟲作用的內生真菌有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、菜豆擬莖點霉（Phomopsisphaseoli）、Melanconium betulinum、Geotrichumsp.AL4、球毛殼菌（Chaetomium globosum）等；內生細菌有假單胞菌屬（Pseudomonassp.）、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等 ；內生放線菌如I07A-01824等。
2、分離培養方法
植物內生菌的分離方法主要有兩大類 ：一類為傳統的分離培養方法 ；另一類為新近發展起來的非培養方法。傳統的培養法分離植物內生菌有很大的局限性，主要歸因于人們對植物內生菌的認識還不夠全面客觀，許多內生菌的生長條件還未確定 ；其次，在篩選過程中，受培養基選擇性的限制，很多寄生程度高、與寄主植物密切相關的固有菌會被漏掉。因此，約有 90%-99% 的環境微生物用傳統的培養法無法進行分離。但因為傳統的培養法能夠得到菌株實體，所以在新物種資源的發掘等方面有著不可替代的作用，仍是微生物資源開發利用的主要方法。研究植物內生菌次生代謝產物及其生物活性，多采用傳統的分離培養法。由于分離培養法具有局限性，為了獲得盡可能多的內生菌，一般采用多種分離培養基對內生菌進行分離。目前，國內學者在分離內生真菌中常用 PDA 培養基、察氏培養基等，為了抑制細菌和其他雜菌的生長，通常還將選擇性生長抑制劑加入到分離培養基中；分離內生細菌常用牛肉膏蛋白胨（NA）、Luria-Bertani培養基（LB）等 ；分離放線菌常用高氏一號培養基、黃豆粉瓊脂培養基等，為防止生長快的菌種阻止或掩蓋生長緩慢菌種，營養貧乏的培養基也常用于分離內生菌。在進行植物內生菌群落結構多樣性研究及種屬鑒定時常用非培養法。
3、活性篩選方法
在植物內生菌殺線蟲活性篩選時，一般采用室內離體試驗和盆栽測效試驗相結合的方法進行。殺線蟲毒力測定和孵化抑制活性測定主要是觸殺法（浸漬法），即將供試線蟲或卵囊放入已配好的內生菌發酵提取物的藥液中，經一定時間處理后，在解剖鏡下檢查線蟲死活和被擊倒的情況或孵化率和線蟲卵的發育進度。繁殖抑制測定一般采用藥劑培養基法、棉球法和培養基噴霧法，這 3 種方法的不同之處在于藥劑培養基法是將藥劑與培養基混合制成藥劑培養基，然后再往培養基上接種供試線蟲；棉球法是將藥劑和供試線蟲注入培養基的棉球上；而培養基噴霧法是將藥液直接噴霧在接種供試線蟲的培養基上。忌避活性測定一般采用藥劑培養基法和棉球法，這里的藥劑培養基法是將培養基配成一定濃度的藥劑培養基，待培養基完全凝固后，將藥劑培養基和對照培養基分別從各自中間分開，然后對半互換，在培養基上接種菌株，待菌長滿平板后在分界線的中央放入脫脂棉球，接種供試線蟲，一定時間后分別取藥劑培養基和對照培養基分離并計線蟲數；而棉球法是在培養皿的中間和邊緣分別放置脫脂棉球，中間棉球接種線蟲，一邊棉球加藥液，一邊棉球加溶劑做對照，一定時間后分別檢查兩邊棉球上線蟲數。雖然繁殖抑制測定和忌避活性測定都用到了藥劑培養基法和棉球法，但在操作上還是有區別的。利用藥劑培養基法進行繁殖抑制測定時，培養皿里的藥劑培養基和對照培養基各自是完整的 ；在進行忌避活性測定時，培養皿里的藥劑培養基和對照培養基分別從各自中間分開，然后對半互換。利用棉球法進行繁殖抑制測定時，是將藥劑和供試線蟲注入培養基的同一個棉球上 ；在進行忌避活性測定時，是將藥劑和供試線蟲注入培養基的不同棉球上。盆栽試驗一般采用灌根法或浸根法進行研究。灌根法是將一定濃度的內生菌發酵液或菌液灌入植株根區的一種施藥方法 ；浸根法是將植物根系在一定濃度的內生菌發酵液或菌液中浸泡一定時間后再移栽的一種施藥方法。
4、活性物質成分
對植物內生菌的研究盡管起步較晚，但發展很快。植物內生菌代謝產物繁多，目前已發現的主要生物活性物質有萜類、生物堿、皂苷類、芳香類、苯丙烷類、有機酸類、多肽類等化合物。關于植物內生菌殺線蟲及其活性物質的研究雖然也取得了一定進展，但還處于起步階段。一方面，僅有少數分離自植物內生菌的殺線蟲化合物被報道，如乙酸，Pregaliellalactone，3-hydroxypropionicacid，l-（2，4-dihydroxyphenyl）-ethanone、1-［（2R*，4S*，5S*）-2-chloro-4-methyl-l，3-oxazinan-5-y1］ethanone 和 1-［（2R*，4S*，5R*）-2- chloro-4- methyl-1，3-oxazinan-5-y1］ethanone，Chaetoglobosin A，（R）-（-）-2-ethylhexan-1-ol和不飽和脂肪酸 5，8-二烯十四酸等。另一方面，從桂皮、香蕉、衣索比亞咖啡、黑胡椒、野生大豆等植物中分離出對植物寄生線蟲或卵有毒殺或抑制作用的內生菌，但這些內生菌殺線蟲活性的有效成分尚不清楚，有待進一步研究。
5、防治植物寄生線蟲的作用機理
植物內生菌防治植物寄生線蟲的機理研究目前還不多，因此，對其作用機理還不太清楚，研究者普遍認為主要表現在通過產生殺線蟲活性代謝物質影響植物寄生線蟲體內各種酶和代謝反應，改變根系分泌物影響植物寄生線蟲的卵孵化以及線蟲的寄生，與植物寄生線蟲競爭營養物質和空間位點影響線蟲的侵染，增強宿主植物的抵抗力、誘導植物產生系統抗性等幾個方面。
5.1 產生殺線蟲活性代謝化合物
線蟲體內存在有各種水解酶類、氧化還原酶和轉移酶類等，這些酶對線蟲的生存為害有著重要的作用。多數內生菌對植物寄生線蟲的影響是通過產生次生代謝產物對線蟲體內不同酶系和代謝反應的作用而致使線蟲活性下降甚至死亡。李洪濤等初步確定了 S506 對線蟲的殺傷作用主要是胞外代謝產物。羅紅麗等通過研究鏈霉菌和諾卡氏菌菌株對根結線蟲卵的寄生率和幼蟲死亡率情況，推測菌株對根結線蟲的拮抗機制可能與菌株的代謝活性產物有關。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）能產生胞外蛋白酶，水解包括線蟲角質層和膠原等，造成線蟲內溶物的泄漏，最終殺死線蟲。有些細菌產生殺線蟲毒素，如蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）在代謝過程中產生晶體蛋白毒素，引起線蟲腸內膜滲透性增大，從而破壞線蟲腸道組織，致使線蟲死亡。有些植物內生細菌如熒光假單胞菌 89B-61（Pseudomonas fluorescens89B-61）、泡囊假單胞菌IN884（Brevundimonas vesicularisIN884）以及枯草芽孢桿菌的代謝物也能夠防治南方根結線蟲。
5.2 改變寄主根系分泌物
根系分泌物能影響線蟲卵孵化、線蟲趨向于根的運動、線蟲與寄主的識別及在根上的寄生與分布。王雪等研究發現感病大豆品種根系分泌物能刺激胞囊線蟲的孵化，而抗病品種根系分泌物對胞囊線蟲的孵化未表現明顯刺激作用。同時，在研究不同抗性品種根系分泌物對大豆胞囊線蟲二齡幼蟲趨化性的影響時還發現，感病品種根系分泌物對大豆胞囊線蟲二齡幼蟲表現了明顯的吸引性。通常一些植物寄生線蟲需要寄主植物產生的某種促進卵孵化的因子，而特定根圍的微生物可消耗根系分泌物或改變分泌形式，從而影響這類線蟲的發育。
如 Westcot III 等認為，施入銅綠假單胞菌（Pse-udomonas aeruginosa）后，小環線蟲的卵很快會停止發育，這可能與細菌影響植物根系的分泌物有關。
5.3 競爭營養和空間位點
具有生防作用的植物內生菌施入土壤后，對植物寄生線蟲的作用機制可能與線蟲競爭營養和空間位點有關。有研究者發現，線蟲與根的相互識別是根表面的外源凝聚素與線蟲體表糖類之間的相互識別。也有研究發現對線蟲有作用的革蘭氏陰性細菌的細胞壁雙層脂膜上具有結合植物外源凝聚素的結構。從以上兩個發現可以推斷某些革蘭氏陰性菌可能與線蟲的生態位部分重疊而發生兩者之間的競爭排斥，競爭的結果是革蘭氏陰性菌憑借數量眾多的優勢優先占據線蟲的侵染位點，并在根部定殖，消耗根圍營養，最終占據空間位點，間接地減少了線蟲侵染率。如 Hallmann 等研究發現棉花內生細菌與線蟲相互作用過程中，有的內生細菌在線蟲侵染部位的種群數量明顯增加，線蟲的侵入可能增加了內生細菌的進入位點。
5.4 誘導植物系統抗性
植物根際促生菌（PGPR）主要通過誘導植物的系統抗性來防治植物病蟲害，而熒光假單胞菌是一類能夠引起植物系統抗性的主要類群。用熒光假單胞菌 P29、P80 菌株和芽孢桿菌 Bl 菌株誘導白三葉草產生對胞囊線蟲（Heterodera trifolii）的系統抗性，能降低雌蟲產卵率或增加雌蟲畸形率。銅綠假單胞菌 IE-6S+ 和 CHAO 兩菌株能誘導番茄產生高于對照 42％和 29％的系統抗性。此外，內生真菌尖孢鐮刀菌菌株 162 也能夠誘導番茄產生抗性，顯著降低南方根結線蟲的感染率。
6、問題與展望
植物內生菌在農業生產中表現出促生、抗病蟲、增強宿主抗性的作用，隨著我國對生態環境的日益重視，對植物內生菌的開發和廣泛應用一定會很快到來。目前，雖然在防治植物寄生線蟲方面取得了一定成效，但在生產實踐中還存在一些問題，主要包括兩個方面 ：一是具有線蟲生防能力的植物內生菌仍然有許多未知的種類需要挖掘，已知的具有生防潛力的內生菌在田間自然條件下定殖能力差。很多植物內生菌的生存和培養條件還不清楚，致使大量的內生菌無法在實驗室條件下分離培養。大多數生防菌是在試驗條件下篩選鑒定的，與田間自然條件有很大區別，這些生防菌在田間施用后往往因定殖能力弱而降低生防效果 ；另一個是缺乏高效穩定的生防菌株。在試驗條件下，有的生防菌的防效不錯，但在田間施用后，由于田間施用、殘留的農藥，種群數量迅速下降而使防效降低 ；且目前生防菌制劑多為活菌制劑，田間應用時常受到溫度、濕度、土壤 pH 值等外界因素的影響而使防效不穩定。
因此，植物內生菌防治植物寄生線蟲的研究應從以下幾個方面努力 ：第一，擴大對殺線內生菌資源種類調查和挖掘，尤其是加強對具有殺線蟲作用新的植物內生菌種類的認識，將更多的內生菌資源有效地應用于線蟲防治，進一步開拓我國線蟲防治的新領域 ；第二，加強對植物內生菌殺線蟲活性成分的研究與應用。目前從殺線內生菌中分離、提純、鑒定殺線蟲活性化合物及應用的研究還處于初步探討階段，今后加強這方面的研究，為新型、高效微生物源殺線劑的研制和合理應用提供科學的理論依據 ；第三，加強對生防內生菌施入土壤后的定殖、消長規律等生態問題的研究和認識，為發揮內生菌在植物寄生線蟲綜合治理中的重要作用奠定基礎。
參考文獻：
［1］路雪君 , 廖曉蘭 , 成飛雪 , 等 . 根結線蟲的生物防治研究進展［J］. 中國農業科技導報 , 2010, 12（4）：44-48.
