作物病蟲害每年給農業生產造成了驚人的損失，而合理有效地使用殺蟲農藥是控制害蟲的有效途徑之一。生物農藥由于具有防治效果好、特異性強、選擇性高、開發利用途徑多、不易產生抗性等特點，已成為發展綠色農業的理想選擇，也是中國農業可持續發展和生態環境保護的重要途徑。微生物源農藥作為生物農藥的主要來源，具有明顯的生態效益、經濟效益和社會效益。因此，開發研究新微生物源農藥已成為當前農藥研究的熱點。

本研究從廣西玉林土壤中分離篩選出一株真菌菌株 YLZ42，通過形態特征，18S rDNA、ITS 序列測定和系統發育分析對其進行鑒定。同時，為研究該菌株是否具有潛在殺蟲利用價值和田間應用前景，測定其發酵液乙酸乙酯萃取物對小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾的殺蟲活性，并對 YLZ42 發酵液活性物質穩定性進行初步研究，旨在為菌株 YLZ42 的進一步研究和應用提供參考。

1、材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 于 2012 年 9 月從廣西玉林等采集土壤樣品 17 份，自然風干，備用。

1.1.2 供試蟲 鹵蟲卵 ：購于成都益友水族，人工海水孵化 ；蚜蟲 ：由四川省農科院植保所提供 ；小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾 ：購于河南濟源白云實業公司，由其提供的飼料孵化。

1.1.3 主要培養基 分離真菌培養基 ：孟加拉紅培養基（購于北京奧博星生物技術有限責任公司）；真菌培養基 ：PDA 培養基 ；發酵培養基 ：葡萄糖 1%，可溶性淀粉 1%，花生餅粉 0.2%，黃豆餅粉 0.2%，蛋白胨 0.1%，KH2PO40.08%，pH7.0 ；大腸桿菌培養基 ：LB 培養基。

1.1.4 主要試劑 DNA Marker、2 TransStartTMFastPfuPCR SuperMix、pEASY-blunt 載體、E.coliTrans-T1 感受態細胞均購于北京全式金生物技術有限公司 ；真菌基因組 DNA 提取試劑盒，18S rDNA、ITS 通用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司提供 ；其他常規試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 將土壤樣品制成菌懸液，進行梯度稀釋后涂布在孟加拉紅培養基平板上，26℃恒溫培養。待長出菌落后，適時挑取形態、顏色不同的單菌落，在 PDA 培養基平板反復劃線培養，直至獲得菌落形態一致的純菌株，作為待測菌株，4℃保藏，備用。

1.2.2 殺蟲活性菌株的篩選

1.2.2.1 樣品制備 挑取待測菌株，接種于發酵培養基中，置于 26℃、180 r/min 搖床連續振蕩培養 5d，過濾除去菌體，收集濾液。取 40 mL 濾液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，35℃減壓濃縮后得浸膏，用1 mL 二甲基亞礬（DMSO）溶解（發酵液 /DMSO ：40/1），再加入 19 mL 體積的無菌水，充分混勻后得到 A 類樣品，備用。另取 10 mL 濾液，作為 B 類樣品，備用。

1.2.2.2 初篩 參考 Solis 的方法，取 A 類和 B 類樣品各 100 μL，分別置于 96 孔板的微孔中，再加入200 μL 的鹵蟲培養液（約 15-35 只鹵蟲），每個樣品3個重復。同時，以蒸餾水及相同濃度的DMSO做空白對照。28℃放置 24 h 后，用雙目解剖鏡觀察，記錄鹵蟲死亡數。在統計總數時，向孔板中滴入 1 滴濃度為 40% 的鹽酸處死所有的鹵蟲，計算校正致死率。校正致死率（%）＝（X-CK）/（1-CK）×100%其中，X 為樣品孔致死率，CK 為對照孔的致死率。

1.2.2.3 復篩 采用噴霧法，從田間采取菊科植物上沾有大量蚜蟲的葉片，將其放置于鋪有濾紙的培養皿中，將 A 類樣品噴霧于葉片上，重復 3 次，室溫（15℃-25℃）培養 24 h 后進行觀察，計算校正死亡率。

1.2.3 活性菌株的鑒定

1.2.3.1 培養特征和形態特征 將菌株接種到 PDA培養基 26℃倒置培養 3-10 d，觀察菌株的氣生菌絲、基內菌絲、孢子顏色等特征。將菌株接種于 PDA 培養基上，26℃插片培養，分別于 3、5 和 7 d 取出玻片，通過光學顯微鏡觀察菌株的形態特征。

1.2.3.2 18S rDNA、ITS序列測定和系統發育分析 采用真菌基因組 DNA 提取試劑盒提取菌株基因組 DNA，作為 PCR 擴增的模板，序列擴增采用真菌通用引物對 ：18S rDNA 引物（NS1 ：5'-GTAGTCAT-ATGCTTGTCTC-3' ；NS8 ：5'-TCCGCAGGTTCACCTA-CGGA-3'），ITS 引 物（ITS1 ：5'-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGC-3' ；ITS4 ：5'-TCCTCCGCTTATTGATATG-C-3'）。PCR 反應體系為 50 μL ：基因組 DNA 1 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，SuperMix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR 反應條件為 ：94℃預變性 5 min ；94℃變性 20 s，55℃退火 20 s，72℃延伸 40 s，共35 個循環 ；72℃終延伸 5 min。擴增產物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后割膠回收純化，回收產物連接pEASY-blunt 載體并轉化至 E.coliTrans-T1 感受態細胞，PCR 驗證陽性克隆子后，交由華大基因科技有限公司測序。測序數據經過拼接后，通過 NCBI網站在線 BLAST 比對分析，調取相關序列。序列經 CLUSTAL X（1.8）比對分析后，用 MEGA5 軟件以鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹，Bootstrap 設置為 1 000 次重復。

1.2.4 生物測定 將菌株發酵液濾液用等體積乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，減壓蒸餾濃縮 30倍后，與人工飼料混拌均勻，通風廚中蒸發干燥 2 h后，分裝于 24 孔板微孔中，再分別加入小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾 3 齡幼蟲，每個孔一頭，每種昆蟲重復 20 孔，于 26℃、相對濕度 60%-70% 的條件下，避光培養，48 h 后觀察、記錄昆蟲狀態和死亡情況。

1.2.5 發酵液活性物質穩定性研究 以鹵蟲為指示蟲，按照 1.2.2.2 的方法測定發酵液在不同條件下處理后的殺蟲活性，根據校正死亡率的改變確定其穩定性。

1.2.5.1 對紫外線和蛋白酶 K 穩定性的測定 取少量 YLZ42 發酵液濾液，在 25 W 紫外燈下（距離約10 cm）照射 3 h，以未處理發酵液濾液為對照測定其殺蟲活性，重復 3 次 ；YLZ42 發酵液濾液中加入蛋白酶 K，使其終濃度為 100 μg/mL，以未處理發酵液濾液為對照，37℃水浴 3 h 后測定其殺蟲活性，重復 3 次。

1.2.5.2 熱穩定性分析 將待測發酵濾液分別置于室溫（25℃）及 40℃、60℃、80℃、100℃四個溫度水浴 30 min 和 60 min，降至室溫后，以鹵蟲為試蟲測定殺蟲活性，計算校正死亡率。

1.2.5.3 酸堿穩定性試驗 分別用 1 mol/L 的 HCl 或1 mol/L的NaOH調節pH，分別調到pH為1、3、5、7、9、11 和 13，然后將各 pH 調回 7 左右，測定殺蟲活性，計算校正死亡率。

2、結果

2.1 菌株分離與殺蟲活性篩選

從土樣中分離出 165 株真菌。殺蟲活性初篩結果（表 1）表明，發酵產物對鹵蟲校正死亡率在60%-100% 的菌株有 6 株，占初篩菌株總數的 40%，其中 YLZ42 的發酵液濾液及乙酸乙酯萃取物對鹵蟲的校正致死率均為 100%。

選取初篩殺蟲效果最好的 4 株菌株，進行復篩，結果（表 2）表明，有 3 株菌株發酵產物對蚜蟲的校正死亡率在 80% 以上，其中 YLZ42 對蚜蟲的致死率 91.4%，校正死亡率為 90.1%。

2.2 菌株YLZ42的鑒定

2.2.1 培養特征和形態特征 菌株在 PDA 培養基上26℃培養 3-10 d，其菌絲生長較緩慢，菌落圓形，具輪紋，白色至灰白色，氣生菌絲不發達，邊緣呈輪紋狀向外擴散，平板背面產生淡黃褐色色素 ；菌絲具隔，分生孢子呈橢圓形、淡色，分生孢子梗為帚狀分枝（圖 1）。與 Rossman，張向民等對生赤殼科（Bionectriaceae）真菌的描述一致。

2.2.2 18S rDNA、ITS 序列測定和系統發育分析 測序所得序列經校對后提交 GenBank，并在 NCBI 上進行 Blast 比較分析。菌株 YLZ42 的 ITS 序列長度為570 bp，登錄號為 KJ145326，與Bionectria ochroleuca（EU273558）序列相似度為 99% ；18S rDNA 長度為 1 767 bp， 登錄號為 KJ145325， 與Bionectriaochroleuca（GU112755）序列相似度為 99%。以 18SrDNA 和 ITS 序列為基礎，根據序列同源性從高到低的順序選取有效菌株序列，經 CLUSTAL X（1.8）比對分析后，利用 Mega5.0 軟件構建系統發育樹（圖2）。從構建的系統發育樹可以看出，菌株 YLZ-42 與Bionectria ochroleuca處于同一分支，親緣關系最近。

2.3 生物測定

菌株 YLZ42 發酵液的乙酸乙酯萃取物對 3 種供試蟲有明顯的毒殺效果，其中，對棉鈴蟲的毒殺效果最好，校正死亡率達 100%，對小菜蛾及甜菜夜蛾的毒殺效果次之，校正死亡率分別為 84.2% 與78.9%，結果如表 3 所示。

2.4 發酵液活性成分的穩定性研究

2.4.1 對紫外線和蛋白酶 K 的穩定性 YLZ42 發酵液濾液分別經紫外線照射3 h和蛋白酶K處理3 h后，其殺蟲活性不變（校正死亡率為 100%），說明殺蟲活性物質對紫外線和蛋白酶 K 不敏感。

2.4.2 熱穩定性 YLZ42 發酵液在 40℃、60℃和80℃三個溫度水浴處理 30 min 和 60 min 后，殺蟲活性幾乎不變。而在 100℃水浴處理 60 min 后，略有降低（圖 3），表明 YLZ42 發酵液殺蟲活性在 40℃-100℃內基本穩定。

2.4.3 pH 穩定性 YLZ42 發酵液在 pH1-11 條件下校正死亡率幾乎沒有變化，表明其殺蟲活性物質在pH1-11 條件下穩定，當 pH 為 13 時，YLZ42 發酵液殺蟲活性消失（圖 4）。

3、討論

隨著人們環保意識的提高，對無公害農產品的需求越來越高。由于微生物源農藥具有明顯的生態效益、經濟效益和社會效益，開發研究新微生物源農藥已成為當前農藥研究的熱點。本研究在進行殺蟲活性篩選時，選用了鹵蟲作為初篩指示蟲，主要是考慮到鹵蟲模型具有檢測快速、操作簡單、廉價等特點和優勢，適于殺蟲活性物質的高通量篩選。鐘佳等就曾以鹵蟲為靶標，對海洋放線菌、植物內生菌代謝物的殺蟲活性進行了篩選。除此之外，在應用該方法進行殺蟲活性快速篩選時，同時測定了菌株的發酵液濾液及其乙酸乙酯萃取物的殺蟲活性，這樣做既能夠保證測量結果的準確性，又為進一步分離純化殺蟲活性物質提供了依據。

生赤殼屬（Bionectria） 是1999 年由 Rossman等根據形態學及分子生物學特征，從叢赤殼科菌種獨立出來而建立的一個新屬，被歸類為生赤殼科（Bionectriaceae），肉座菌目（Hypocreales）。由于是新定義的一個屬，所以國內外對其研究相對較少。

目前，國內研究報道主要集中于淡色生赤殼菌對植物病原菌的防治，如陸錚錚等報道了淡色生赤殼菌對煙草青枯菌的拮抗作用，余艷等報道了淡色生赤殼菌的抗菌和殺細胞作用，但鮮有人對其殺蟲活性進行過研究和報道。通過鹵蟲模型，本研究分離篩選出一株具有殺蟲活性的淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca）YLZ42。生物測定表明該菌株發酵液的乙酸乙酯萃取物對小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾有較好的毒殺效果，具有潛在的殺蟲利用價值和田間應用前景。同時，利用鹵蟲為指示蟲，對YLZ42 發酵液穩定性進行了初步研究，豐富了淡色生赤殼菌的研究內容，也為后續研究中對殺蟲活性物質的功能研究和結構解析等提供了參考。

4、結論

通過鹵蟲篩選模型，篩選了一批具有殺蟲活性的真菌菌株。其中 YLZ42 的代謝物對鹵蟲的校正致死率為 100%，對蚜蟲校正死亡率為 90.1%。通過培養特征、形態特征以及 18S rDNA、ITS 序列系統發育分析，鑒定菌株 YLZ42 為淡色生赤殼菌（Bionectriaochroleuca）。YLZ42 發酵液乙酸乙酯萃取物對小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾具有明顯的毒殺活性，其校正死亡率在 78.9% 以上。YLZ42 發酵液的穩定性分析表明活性成分在 100℃處理 60 min，pH1-11 條件下仍具有較強的殺蟲活性。

參考文獻：
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［2］施躍峰 . 微生物殺蟲劑研究進展［J］. 植物保護 , 2000, 5 ：32-34.