幾十年以前人們已經開始利用微生物來控制害蟲。蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱 Bt）是一種獨特的細菌，它與許多化合物一起用于防治害蟲，并且已經商業化，對農業和環境有重要貢獻。盡管其它細菌，包括乳狀芽胞桿菌（Bacilluspopilliae）和球形芽胞桿菌（Bacillus sphaericus），也用作微生物殺蟲劑，但是它們的殺蟲活性譜與 Bt 相比十分有限。重要的是，Bt 對人類是安全的，也是世界上應用最廣泛的環境友好型生物殺蟲劑。Bt 殺蟲基因已經轉化到幾種主要的作物中，獲得了抗蟲的轉基因植物，進而提供了農業遺傳工程模型。
第 9 版的《伯杰氏細菌鑒定手冊》將其歸屬于第二類第十八群，革蘭氏陽性，芽胞桿菌屬的一個種。
Cry1 類殺蟲晶體蛋白對多種鱗翅目害蟲具有高效的殺蟲活性，是 Bt 殺蟲晶體蛋白中研究最為深入的一類，目前殺蟲晶體蛋白的作用方式主要是通過 Cry1類蛋白進行研究的。隨著cry1類基因在殺蟲工程菌和轉基因抗蟲植物中的廣泛應用，抗 Bt 毒素的昆蟲已經出現，由于這一威脅，人們希望得到能同時作用在同一害蟲上的不同種類的 Bt 蛋白。由于 Cry2Aa蛋白對鱗翅目和雙翅目都有活性，所以對 Cry1 類蛋白產生抗性的昆蟲，Cry2Aa 蛋白對其也有活性。
Cry2Aa 與 Cry1Aa 的氨基酸序列同源性只有 20%。
然而這兩種蛋白的三維空間結構非常相似。這說明 Cry2Aa 蛋白的殺蟲機制和許多其它 Cry 蛋白的殺蟲機制相似。所以應用 Cry2Aa 來減緩抗性昆蟲的出現是有價值的。人們已經提出交替使用 Cry1A 類和 Cry2A 類蛋白來解決抗性問題。長期以來，新型 Bt 基因的分離、篩選以及培育轉 Bt 殺蟲基因植物，一直是世界上眾多國家研究的熱點。因此充分發掘我國 Bt 殺蟲基因資源已經成為一項極有價值的工作。為此，本研究從土壤中分離 Bt 菌株并篩選和克隆殺蟲基因，以期獲得具有較高殺蟲活性的新型cry1類和cry2類基因。
1、材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株與質粒 本研究涉及的菌株和質粒見表1。
1.1.2 培養基 液體 LB 培養基 ：1.0% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1.0% 氯化鈉，pH7.0。固體 LB培養基：在液體 LB 培養基中加1.3%瓊脂。固體1/2LB培養基 ：1.0% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1.0%氯化鈉、1.3% 瓊脂，pH7.0。
1.1.3 試劑 限制性內切酶及連接酶、Pfu購自GiBcol、TaKaRa 公司。dNTP、Taq酶等購自上海生工生物工程公司。分析純化學試劑均為市售。
1.1.4 試蟲 小菜蛾（Plutella xylostella）、棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）和亞洲玉米螟（Ostriniafurna-calis）來自中國農科院植物保護研究所提供的標準化試蟲。
1.1.5 PCR 擴增引物 鑒定引物與全長引物均由上海生工合成。引物序列見表 2。
1.2 方法
1.2.1 晶體形態觀察 將 Bt 菌株 V4 在 1/2LB 培養基上培養 48 h 后，將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復紅染液染色 3 min，清水沖洗，100× 油鏡進行鏡檢，石炭酸復紅染液配制方法參見文獻［11］。顯微鏡下觀察晶體釋放后，刮取培養物 100 mg 用滅菌蒸餾水洗 3-4 遍，懸浮于1 mL 無菌水中，將芽胞和晶體混合液滴于玻璃片上，待其干燥，經鋨酸固定后酒精梯度脫水，臨界點干燥，離子濺射噴金（2 nm），HITACHI S -3400N 掃描電鏡觀察拍照。
1.2.2cry1Ea基因和cry2Aa基因的鑒定及測序 參照宋福平等方法，通過cry1類全長通用引物L5un3/L3un3、cry2類半長通用引物 S5un2/S3un2，以 Bt 菌株 V4 基因組為模板，利用Taq聚合酶進行PCR 擴增，PCR 反應體系為模板 1 μL，引物對各 1μL，2× Taqmix 10 μL，ddH2O 補至 20 μL。PCR 反應 程 序 ：94℃ 8 min ；94℃ 1 min 53℃ 1 min，72℃4 min，30 個循環 ；最后 72℃延伸 10 min。獲得的cry1類 PCR 產物進行 PCR-RFLP 酶切分析，隨后將PCR 產物回收與 pMD19-T 載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌 JM109，篩選出陽性轉化子，送于上海生工測序。按照已經發表的cry2Aa基因序列，參照文獻設計了擴增全長cry2Aa開放閱讀框的引物Q2AaF/Q2AaR，并進行cry2Aa全長基因的擴增，引物序列見表 2。
1.2.3cry1Ea和cry2Aa基因序列測定、誘導表達及SDS-PAGE 分析 以 BtV4 菌株的基因組為模板，利用 KOD 高保真 DNA 聚合酶進行 PCR 擴增。PCR 反應體系為 ：模板 1 μL，引物對各 1 μL，MgSO43 μL，dNTPs 5 μL，10×Buffer 5 μL，KOD 酶 1 μL，ddH2O補 至 50 μL。PCR 反應程序 ：94℃ 2 min ；98℃ 10s，51℃（cry1Ea）/54℃（cry2Aa）30 s，68℃ 4 min（cry1Ea）/2 min（cry2Aa），30 個循環 ；最后 68℃延伸 10 min。之后參考文獻［14］。
1.2.4 Cry1Ea 蛋白純化和 Western blot 印跡 Cry1Ea蛋白純化用康為世紀的 Ni-Agarose His 標簽包涵體蛋白純化試劑盒進行純化。用 Bio-Rad Mini Trans-BlotElectrophoretic Transfer Cell 裝置進行 Western blot，封閉液為 5% 脫脂牛奶，一抗為 Mouse Anti-His TagMonoclonal Antibody， 二 抗 為 Peroxidase-ConjugatedAffiniPure Goat Anti-Mouse lgG（H+L）。利用 AEC 酶底物試劑盒進行顯色反應。
1.2.5 生物活性測定 采用飼料混合法進行殺蟲生物活性測定。將 10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）溶解的粗提蛋白制備成蛋白樣品溶液，將粗提蛋白溶液與飼料攪拌混勻，分裝于經過消毒的培養皿中，挑選活躍的初孵幼蟲接于飼料上，進行生物活性測定，每個處理重復 3 次，小菜蛾和玉米螟每個重復為 30 頭試蟲，棉鈴蟲每個重復為 24 頭試蟲。將 10 mmol/LTris-Cl（pH8.0）溶液作為陰性對照，利用同樣的方法處理 Cry1Ac 蛋白作為陽性對照。試蟲的飼養條件為 28℃、相對濕度為 70%-80% 的光照培養箱中培養，小菜蛾初孵幼蟲飼育 48 h、棉鈴蟲和玉米螟初孵幼蟲飼育 168 h 后調查死、活蟲數量。
2、結果
2.1 晶體形態觀察
Bt 菌株 V4 產生的晶體形態，如圖 1 中光學顯微鏡下箭頭所示，從左到右依次為雙錐形晶體和立方形晶體 ；電鏡圖片中箭頭所指，從左到右依次為立方形晶體和雙錐形晶體。
2.2cry1Ea基因和cry2Aa基因的鑒定
PCR 鑒定發現 Bt V 菌株中含有cry1類cry2類基因，應用引物 L5un3/L3un3 和 S5un2/S3un2 對 BtV4 菌株的基因組進行 PCR 擴增結果，見圖 2 和圖 3。對cry1類全長基因進行 RFLP 酶切分析，確定該基因為cry1Ea基因（圖 4）。參考測序結果，登錄 NCBI 進行序列比對，發現該菌株含有cry2Aa基因。利用全長引物 Q2AaF/Q2AaR 擴增 V4 菌株中的cry2Aa基因，PCR 擴增結果見圖 5。
2.3cry1Ea和cry2Aa全長基因的克隆和表達
利用全長引物 L5un3/L3un3 和 Q2AaF/Q2AaR擴增 BtV4 菌株中的cry1Ea和cry2Aa基因，將擴增產物分別克隆到 pEB 載體并篩選平末端連接正確的重組質粒 pEB1Ea12 和 pEB2Aa16。對重組質粒pEB1Ea 和 pEB2Aa 基因的測序結果顯示，BtV4 菌株中的cry1Ea全長基因大小為 3 507 bp，編碼 1 169個氨基酸殘基，分子量為 130 kD，并在國際基因庫GenBank 中登記，其登錄號為 KF601559，由 Btδ-內毒素基因國際命名委員會正式命名為cry1Ea12。該菌株中的cry2Aa全長基因大小為 1 917 bp，編碼639 個氨基酸殘基，分子量為 60 kD，并在國際基因庫 GenBank 中登記，其登錄號為 KF667522，由 Btδ-內毒素基因國際命名委員會正式命名為cry2Aa16。
其中，cry1Ea12與cry1Ea11相似性最高，相似度為98.12%，有 65 個堿基差異 ；cry2Aa16與cry2Aa15相似性最高，相似度為 99.47%，有 7 個堿基差異。
對cry1Ea和cry2Aa基因進行誘導表達，對表達產物進行的 SDS-PAGE 電泳分析結果（圖 6）顯示，兩種表達蛋白被檢測均在沉淀組分中，轉入重組質粒 pEB1Ea12 的 Rosetta（DE3）菌株中檢測到130 kD 的目的蛋白，在轉入重組質粒 pEB2Aa16 的Rosetta（DE3）菌株中檢測到 60 kD 的目的蛋白，與Bt 菌株 V4 產生的蛋白大小一致。以空質粒 pEB 轉入 Rosetta（DE3）菌株作為陰性對照，未發現表達的 130 kD 或 60 kD 的蛋白，以上結果說明在大腸桿菌中成功的表達了上述蛋白。
2.4 Cry1Ea蛋白的純化和Western blot印跡
為了進一步驗證cry1Ea基因表達是否正確以及蛋白純度，對 Cry1Ea 蛋白進行純化，并進行 SDS-PAGE 蛋白電泳，結果見圖 7。Western blot 印跡結果，見圖 8。
2.5 Cry1Ea和Cry2Aa及BtV4蛋白殺蟲活性的測定
提取 Cry1Ea 和 Cry2Aa 表達產物的沉淀組分以及 Bt 菌株 V4 蛋白進行殺蟲活性測定，本試驗進行了初篩殺蟲活性測定。將 3 種蛋白分別設定一個濃度處理，對小菜蛾和棉鈴蟲為 20 μg/g，對亞洲玉米螟為 50 μg/g，每個處理重復 3 次，并用 10 mmol/LTris-Cl 溶液作為陰性對照。初篩結果（表 3）表明，Cry1Ea 和 Cry2Aa 蛋白對 3 種害蟲的殺蟲活性很低，但表現出明顯的體重抑制，而同時含有該兩種蛋白的 Bt 菌株 V4 蛋白的殺蟲活性很高。由于供試昆蟲數量不足，沒有對 Cry1Ea 純化蛋白進行生物活性測定，也沒有做 Cry1Ea 和 Cry2Aa 兩種蛋白的混合增效試驗，有必要后續繼續進行這兩個試驗。
3、討論
本研究通過 PCR 擴增反應以及 PCR-RFLP 酶切鑒定，首先確定 Bt 菌株 V4 含有cry1Ea基因，隨后發現該菌株也含有cry2Aa基因。Bt 菌株 V4 同時含有cry1Ea和cry2Aa基因，對兩種基因表達的蛋白進行殺蟲活性測定，結果并不理想。有 3 種可能解釋殺蟲活性的測定結果 ：一是由于堿基的差異導致Cry1Ea12 和 Cry2Aa16 蛋白的空間構象發生改變，致使其殺蟲活性明顯降低，Cry1Ea 和 Cry2Aa 蛋白對小菜蛾活性很高并且與其它蛋白具有顯著的協同增效作用，而 Cry2Aa 與 Cry1A 類蛋白作用于昆蟲的受體不同，這能夠解釋為什么 Cry2A類蛋白能殺死對 Cry1A 類蛋白產生抗性的昆蟲，所以 Cry1Ea 蛋白和 Cry2Aa 蛋白有可能具有協同增效作用，極大增加彼此的殺蟲活性，但由于供試昆蟲數量不足，并沒有做兩種蛋白的協同增效試驗 ；二是有可能存在其它未知基因，表達的蛋白具有很高的殺蟲活性 ；三是本試驗采用包涵體蛋白進行生物活性測定，但是包涵體蛋白降解速率較快，而生物活性測定時間較長，這可能導致殺蟲活性的降低。
此外，Cry2Aa 蛋白對雙翅目也有高活性，可以對本試驗的兩種蛋白進行其它不同害蟲的生物活性測定，因此有必要進行后續研究和重復性試驗，這對于構建高效工程菌、轉抗蟲基因植物、解決昆蟲對殺蟲基因產生抗性等問題是有意義的。
4、結論
以本實驗室分離得到的 300 株蘇云金芽胞桿菌菌株 DNA 基因組為模板，利用cry1類全長通用引物進行 PCR-RFLP 基因鑒定，發現 Bt 菌株 V4 含有cry1Ea基因，克隆基因全長序列為 3 507 bp，編碼 1 169 個氨基酸殘基，分子量為 130 kD，并在國際基因庫 GenBank 中登記，其登錄號為 KF601559，由 Btδ-內毒素基因國際命名委員會正式命名為cry1Ea12。同時發現該菌株還含有cry2Aa基因，克隆基因全長序列為 1 917 bp，編碼 639 個氨基酸殘基，分子量為 60 kD，并在國際基因庫 GenBank 中登記，其登錄號為 KF667522，由 Btδ-內毒素基因國際命名委員會正式命名為cry2Aa16。將兩種基因在大腸桿菌 Rosetta（DE3）中表達，并表達蛋白進行殺蟲活性測定，兩種基因表達的蛋白殺蟲活性不高，但 Bt菌株 V4 蛋白具有較高的活性。
