水稻稻瘟病是世界性的重要真菌病害,病害流行的年份嚴重影響水稻產量和稻米品質,在很多重病區甚至顆粒無收。選育和利用抗病水稻品種是防治稻瘟病的最有效措施,但稻瘟病菌生理小種不斷變化且變異較快,育成的抗病水稻品種通常種植數年后極易喪失抗性。水稻品種喪失抗病性的主要原因是稻瘟病菌生理小種的變化以及新生理小種的出現和積累,因此,了解田間稻瘟病菌生理小種的變化動態和潛在致病小種的發展趨勢,是水稻抗瘟性品種選育、新品種推廣、品種合理布局和稻瘟病防治的重要課題,也是水稻病害可持續控制的長期任務。
水稻稻瘟病菌\\(Magnaporthegrisea\\)生理小種監測是一項十分重要的工作,現在以多點、多面、多寄主地采樣分離單孢菌株測定其小種類型,可準確反映某一地區總體稻瘟病菌生理小種組成與分布情況,但這種方法工作量較大且費時費力。本試驗從江西省井岡山稻瘟病抗性鑒定基地種植的不含已知抗瘟基因品種麗江新團黑谷\\(Lijiangxintuan-heigu,LTH\\)稻瘟病菌標本中分離單孢菌株,利用7個中國傳統鑒別品種和30個單基因抗瘟品系分別測定稻瘟病菌致病性分化情況及其無毒基因,并與這一地區多點不同品種標本分離的稻瘟病菌致病性分化情況進行比較,旨在明確LTH稻瘟病菌群體構成與當地整體稻瘟病菌群體的相關性,為監測稻瘟病菌生理小種和鑒定品種抗性基因的研究提供新途徑。
1、材料與方法
1.1供試材料
供試菌株:從江西省井岡山稻瘟病抗性鑒定基地種植的LTH采集分離的100個有效單孢菌株和從其他20個水稻品種上分離的200個單孢菌株。供試品種:中國農業科學院作物栽培研究所育成的6個水稻抗稻瘟病近等基因系和國際水稻研究所與日本合作育成的24個水稻抗稻瘟病單基因系\\(表1\\);7個中國鑒別寄主特特勃、珍龍13、四豐43、東農363、關東51、合江18和LTH均由廣東省農業科學院朱小源博士惠贈。
1.2接種孢子液的制備
單孢菌株在含PDA培養基試管里培養7~10d后轉接到玉米粉稻稈瓊脂培養基上擴大培養7~9d,然后在黑光燈下光照培養3~4d。用無菌水沖洗孢子,將接種孢子液濃度調至1×105個/mL備用。菌株培養及產孢均在25℃下進行。
1.3致病性的測定
水稻種子催芽后穴播于長35cm、寬30cm、高5cm的塑料育秧盤里\\(50個孔\\),每盤播37份材料,每份材料播種量為8~10粒。采用旱育秧,待秧苗長至2葉1心期,每盤施尿素0.5g,接種前共施3次。待秧苗長至3.5~4.0葉齡,用制備的孢子液進行人工噴霧接種,接種菌液量為每盤40mL。接種前在孢子懸浮液中加入0.1%吐溫20,接種后將秧苗置于培養箱中暗培養,在25℃下保濕24h。
之后置于溫室,在25~28℃下保濕至秧苗發病,接種7d后進行抗性測定。每個菌株的致病性測定均設2個重復。病級調查按國際水稻研究所稻瘟病圃苗瘟分級標準進行,1~3級為抗病、4~9級為感病,并按照中國稻瘟病菌生理小種聯合試驗組提出的方法劃分稻瘟病菌生理小種。
1.4致病率與毒力頻率的計算
致病性測定參照楊秀娟等的方法進行,單個菌株對所有測試水稻品種\\(基因\\)的致病率\\(patho-genicfrequency,PF\\)=\\(感病的水稻品種數/所有測試水稻品種數\\)×100%,其中PF≥70%為強致病力,50%≤PF≤69%為較強致病力,29%≤PF≤49%為中等致病力,PF<30%為弱致病力。
稻瘟病菌無毒基因的出現頻率\\(occurancefre-quency,OF\\)=\\(出現某個無毒基因的菌株數/總菌株數\\)×100%。
2、結果與分析
2.1同一寄主稻瘟病單孢菌的生理小種利用
7個中國傳統鑒別品種和30個近等單基因系抗瘟品種,對100個從LTH稻瘟病菌標本中分離的單孢菌株分別測定生理小種和致病力。試驗結果表明,測試菌株可分為3個種群11個小種,其中ZA占85.00%,ZB占13.00%,ZC占2.00%\\(圖1\\)。
來源于寄主品種LTH稻瘟病菌致病性測定結果表明,所有菌株的毒力頻率為63.33%~96.67%\\(表2\\)。ZA種群包括ZA1\\(69%\\)、ZA5\\(8%\\)、ZA7\\(1%\\)、ZA11\\(2%\\)、ZA13\\(2%\\)、ZA15\\(3%\\),ZB種群包括ZB1\\(4%\\)、ZB13\\(7%\\)、ZB15\\(2%\\),ZC種群包括ZC1\\(1%\\)、ZC13\\(1%\\)。100個單孢菌株中對30個單基因抗病品種的毒力頻率最高為100%,最低為63.33%,平均83.33%,其中毒力頻率在60%以下、60%~80%、80%~100%所占比例分別為0、39%、61%。
分析結果表明,從同一品種病標樣中分離的稻瘟病單孢菌株包含有不同的生理小種種群和生理小種,但其中某一種群和某一生理小種占絕對優勢,如ZA種群菌株數占85%,而ZA1小種菌株數占69%。分離的單孢菌株的致病力也有差異,對30個單基因抗病品種的毒力頻率范圍為63.33%~100%。測定結果顯示,分離出的100個單孢菌株都是中等致病力和強致病力菌株,分別占39%和61%,且未測得弱致病力菌株。
2.2同一地區LTH與其他品種稻瘟病菌的致病性
從LTH稻瘟病菌標本中分離的100個單孢菌株可劃分為ZA、ZB、ZC3個種群;同一地區種植的其他20個水稻品種標本分離的200個稻瘟病單孢菌株可劃分為ZA、ZB、ZC、ZD4個種群,優勢小種為ZA1\\(32.69%\\)、ZB13\\(15.38%\\)、ZB15\\(7.69%\\),對30個抗瘟單基因系的平均致病頻率為78.01%\\(表3\\)。
測定結果顯示,不含任何抗瘟基因品種LTH的稻瘟病菌致病性分化,包括生理小種組成、優勢小種構成及出現頻率、致病力強弱等與同一地區總體稻瘟病菌致病性的分化高度相符。
2.3同一寄主稻瘟病單孢菌無毒基因的測定利用
30個已知抗瘟基因的單基因系抗病品種接種從LTH稻瘟病菌標本中分離的100個稻瘟病單孢菌,根據Flor的基因對基因學說,由鑒定品種的抗感反應推導出所接種稻瘟病菌所含的無毒基因\\(表4\\)。
由表4可知,除Avr-a\\(2\\)外,其余29個無毒基因均有出現,其中Avr-k、Avr-zt、Avr-z5、Avr-1\\(1\\)、Avr-k與Avr-k\\(C\\)等6個無毒基因在出現頻率都高于50%,說明與之相對應的抗瘟基因的水稻品種在該地區可以應用。
3、討論
稻瘟病的普遍發生,給水稻生產造成極大危害。
為了減少稻瘟病造成的損失,越來越多的研究者不斷采用不同的鑒別品種進行生理小種的研究和監測。了解生理小種的類型分布和變異規律,尤其是優勢生理小種的動態變化和致病性變異趨勢,掌握當地生理小種對單基因品種的致病性,對抗病品種的合理利用和抗性基因的有效挖掘有重要意義。
本試驗選用不含已知抗瘟基因的水稻品種麗江新團黑谷\\(LTH\\)作為稻瘟病寄主品種分離稻瘟病菌進行生理小種測定,分離到的100個稻瘟病單孢菌株可劃為ZA、ZB、ZC3個種群,出現頻率分別為85.00%、13.00%、2.00%,優勢小種分別為ZA1\\(69%\\)、ZA5\\(8%\\)、ZB13\\(7%\\),對30個抗瘟單基因系的平均致病頻率為83.03%;同時在同一地區種植的其他20個水稻品種標本分離的200個稻瘟病單孢菌株可劃分為ZA、ZB、ZC、ZD4個種群,優勢小種為ZA1\\(32.69%\\)、ZB13\\(15.38%\\)、ZB15\\(7.69%\\),對30個抗瘟單基因系的平均致病頻率為78.01%。試驗結果表明,從LTH分離的稻瘟病菌種群與當地總體稻瘟病菌的種群構成和致病力十分相近,因此,可以在某一地區LTH稻瘟病菌標本上分離單孢菌株來測定該地區的稻瘟病菌生理小種。
了解這一地區的稻瘟病菌生理小種類型分布和變異規律,可以減少從眾多寄主品種上分離稻瘟病菌來測定這一地區的稻瘟病菌小種類型,從而節省大量人力物力。今后將繼續在多點多年份采集稻瘟病菌標本,以進一步驗證此結果。
掌握一個地區稻瘟病菌的種群動態和優勢小種,獲得有價值的抗病基因信息和材料,有利于育種專家采用分子標記等方法選育抗病品種,因此,生理小種的研究熱點將會從鑒定小種型向生理小種包含的無毒基因轉變,對生理小種的分布研究也將轉化為無毒基因的分布研究。本試驗在30個抗瘟單基因品系上,接種來自LTH的稻瘟病菌,通過抗感反應結果,依據Flor的基因對基因學說,推導接種稻瘟病菌所含的無毒基因。結果顯示:在100個稻瘟病菌株中共出現29個與供試抗瘟單基因品系所對應的無毒基因,其中Avr-k、Avr-zt、Avr-z5、Avr-1\\(1\\)、Avr-k與Avr-k\\(C\\)等6個無毒基因出現頻率都高于50%,說明與之相對應的抗瘟基因在該地區的抗病育種中有重要的應用價值;Avr-a\\(2\\)沒有在所接種的菌株出現,因此,所含與之對應的抗瘟基因品種應當在該地區慎用。
LTH是一種不含已知抗瘟基因的水稻品種,在理論上可以侵染它的稻瘟病菌很多,因此,從LTH稻瘟病菌標本上分離單孢菌株來測定某一地區的稻瘟病菌生理小種構成與動態變化具有一定的代表性和可信性,這在本試驗結果中已得到初步驗證。利用30個抗瘟單基因品系接種從LTH上分離到的稻瘟病菌,可以了解該地區稻瘟病菌的致病力強弱和所含無毒基因等信息,故加強從LTH分離稻瘟病菌的致病性分化研究,對當地稻瘟病的防控具有重要意義。
參考文獻：
[1]沈瑛,ADREITH,朱旭東,等.中國部分雜交稻和常規早秈、晚粳品種\\(系\\)的抗瘟性[J].中國農業科學,2004,37\\(3\\):362-369.
[2]李墻富,任斌,賈龍.寧夏水稻主栽品種抗稻瘟病性鑒定研究[J].寧夏農學院學報,2003,24\\(3\\):6-10.
[3]陳家豪,張學博,曾汗章,等.福建早稻主栽品種\\(組合\\)抗瘟性鑒定及其影響因素[J].福建農業大學學報,2000,29\\(3\\):346-350.
[4]彭紹裘,劉二明,黃費元,等.水稻持久抗瘟性研究[J].植物保護學報,1996,23\\(4\\):293-299.
[5]黃瑞榮,華菊玲,王梅和,等.江西省稻瘟病發生流行趨勢和治理對策探討[J].江西農業學報,2006,18\\(5\\):80-82.
[6]劉志恒,王經緯,楊紅,等.2005-2007年遼寧省稻瘟病菌種群動態分析[J].沈陽農業大學學報,2009,40\\(3\\):282-285.
[7]郭曉莉,劉曉梅,李莉,等.吉林省稻瘟病菌生理小種及變化規律研究[J].吉林農業科學,2009,34\\(3\\):33-35.
[8]范靜華,陳海如.云南稻瘟病菌生理小種及變化規律研究[J].云南農業科技,1998\\(5\\):18-21.
[9]肖佳雷,張國民,辛愛華,等.黑龍江省2006年水稻主產區稻瘟病生理小種動態分析[J].東北農業大學學報,2009,40\\(3\\):12-15.
