石斛屬（Dendrobium spp.）是蘭科植物的第二大屬，目前該屬在全世界共發現 1100 多種，在我國有 76 個種和 2 個變種。其中，石斛屬藥用植物金釵石斛（D. nobile Lindl）是傳統名貴中藥，被我國歷版藥典所收錄，以其干燥或新鮮的莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津之功效。由于近年來石斛屬藥用植物被過度挖掘，野生資源瀕臨枯竭，石斛屬藥用植物已被國家列為一級保護植物名錄。

隨著人們對石斛中藥材需求量的逐漸增加，目前藥用石斛屬植物人工栽培的面積不斷擴大。然而，隨之而來的各種病害不斷出現，嚴重阻礙了人工栽培的進一步發展，并給種植戶帶來了巨大的經濟損失。有研究表明，鐘器腐霉曾在云南省導致大規模鼓槌石斛、球花石斛、線葉石斛莖部的腐爛。在以往的研究中，我們鑒定出金釵石斛軟腐病的病原真菌為終極腐霉。

為深入研究軟腐病病原菌終極腐霉的致病機理，探討其在導致金釵石斛軟腐病病害過程中的機制，金釵石斛的根、莖和葉等部位發生的顯微、超微結構變化以及病原菌在植物體內的分布和侵染情況，本研究采用水壓片法以及掃描電鏡觀察法分別對接種終極腐霉病原菌前后金釵石斛苗的根、莖和葉的結構變化進行觀察，為深入理解病原菌的侵染過程，揭示其形態學特征和侵染機制，以及為更好預防和控制此病害的發生發展提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

金釵石斛組培苗為本實驗室保存。

1.1.2 主要儀器

ZEISS Axio Imager A1 型光學顯微鏡購自德國蔡司公司；JSM-6510 LV 型掃描電子顯微鏡購自日本電子株式會社。

1.2 方法

1.2.1 病原菌

終極腐霉對金釵石斛的致病性試驗 將剛出瓶的生長一致的株高 4 ~ 6 cm 的新鮮金釵石斛組培苗預先栽種在裝有滅菌的栗樹皮基質的塑料花盆內，每個花盆栽種 3 株組培苗。病原菌為金釵石斛發病植株上分離得到的終極腐霉。

采用孢子噴灑葉片的方法進行致病性試驗，接種的病原菌為孢子懸浮液（1 × 106個/ml），均勻地噴灑于金釵石斛幼苗的葉片上。對照組噴灑無菌水。

致病組和對照組均設 30 個重復。接種后置于 20 ~25 ℃ 溫室塑料膜保濕培養 48 h，然后揭去塑料膜，每天觀察植株發病情況。

1.2.2 常規水壓片法進行光鏡觀察

取 1 滴10% KOH 溶液滴加到載玻片上，然后取健康的和發病 48 h 的金釵石斛的葉片作為觀察對象，徒手切片法切取盡量薄的葉片組織，浸入 KOH 溶液中裝片，光學顯微鏡下觀察、照相。

1.2.3 掃描電鏡樣品的制備流程

取健康的以及發病 48 h 的金釵石斛的根、莖、葉等部位，用于制作掃描電鏡樣品，樣品的處理按文獻[8]進行：

2.5% 戊二醛室溫下固定 4 ~ 6 h 后，以 PBS（pH6.8，0.1 mol/L）洗滌 3 次，每次 30 min；分別經30%、50%、70%、80%、90% 以及 100% 丙酮梯度脫水，每個梯度 3 次，每次 30 min；再經純醋酸異戊酯置換 3 次，每次 30 min；經 CO2臨界點干燥、粘樣，再經過金離子噴濺，最后于掃描電子顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果

2.1 光學顯微鏡觀察

致病前后金釵石斛葉片顯微結構的變化在光學顯微鏡下，正常的葉肉細胞細胞壁較厚，排列規則，葉綠體分布于細胞的周邊（圖 1A），而發病的葉肉細胞壁變薄，細胞完整性受到破壞，葉綠體分散、零亂（圖 1B，C）。終極腐霉病原菌在金釵石斛葉片內大量存在，菌絲生長旺盛，直徑可達 11 μm，菌絲體內充滿泡囊（圖 1C 黑色箭頭所示），且具有流動性，這與終極腐霉有關的形態描述相一致。大量的卵孢子和孢子囊分布在葉肉細胞間或內部，卵孢子壁厚 2 ~ 3 μm（圖 1B）。



2.2 掃描電子顯微鏡觀察

致病前后金釵石斛根、莖、葉結構變化。

2.2.1 金釵石斛植株被病原菌侵染前后的根表面和橫切面顯微結構 由圖 2 可以看出，未被病原菌侵染的金釵石斛植株根的表面結構保持完整（圖2A），根被細胞顯示出典型的網狀纖維樣結構，皮層細胞結構較完整，其體積明顯比根被細胞大，有較多顆粒樣物質（圖 2B 上箭頭），推測為淀粉粒樣的結構，根的中柱髓部（圖 2B 下箭頭）結構也較完整，細胞排列規則。被病原菌侵染的金釵石斛植株根的表面分布有大量的病原菌終極腐霉的菌絲（圖 2C 箭頭），病原菌菌絲體穿過根被死亡細胞表面的各種孔洞，在根部蔓延和穿行，交織成網狀，進而深入根皮層細胞，破壞皮層細胞的細胞壁而導致細胞的壞死（圖 2C，D），終極腐霉高密度分布是宿主植物發病的基礎，同時說明這種土傳植物病害病原菌終極腐霉首先必須在基質中侵入根部組織進而侵染其他組織導致植株的發病和死亡，這為我們提供了終極腐霉侵染植株直觀的顯微依據。



2.2.2 金釵石斛植株被病原菌侵染前后的莖表面顯微結構 由圖 3 可以看出，未被病原菌侵染的金釵石斛植株莖表面保持完整的結構，莖葉鞘部位細胞縱向分布，排列極其規則，散在分布有氣孔樣結構（圖 3A）。金釵石斛植株受到病原菌侵染后，終極腐霉菌絲大量在莖表面穿行（圖 3B 白色箭頭\\)、縱橫交錯，使該部位的結構完整性受到嚴重破壞，莖表面出現了大大小小的孔洞；金釵石斛莖表面的終極腐霉菌絲產生分支（圖 3B 黑色*）后，通過機械穿透作用進入組織內部（圖 3B 白色*），后又穿行暴露于莖表面（圖 3B 黑色**）；終極腐霉菌絲出現不規則膨大，形成附著胞，并牢牢地黏附在莖表面（圖 3B 黑色箭頭\\)，并將繼續侵染植株的深部組織。



2.2.3 金釵石斛植株被病原菌侵染的葉背面和橫切面顯微結構 圖 4A 顯示未被病原菌侵染的金釵石斛植株葉部的完整結構，橫切面可以看到完整的維管束結構。圖 4B 顯示許多終極腐霉菌絲末端膨大，縱橫排列，形成類似吸盤的特殊結構（圖 4B黑色箭頭），牢固地附著于葉背面，從多個角度和部位黏附、侵染葉背面。圖 4C 顯示大量病原菌菌絲從氣孔處爭相侵入寄主體內。圖 4D 顯示終極腐霉菌絲在氣孔處發生斷裂后，可見許多泡囊結構，這是終極腐霉的典型特征之一。


2.2.4 金釵石斛植株被病原菌終極腐霉侵染的葉表面形態結構 由圖 5 可以看出，葉表面分布的病原菌菌絲體中間出現膨大形成典型的孢子囊結構（圖 5A 黑色箭頭）。圖 5B 示藏精器（黑色箭頭）和藏卵器（白色箭頭）的結構，它們是終極腐霉病原菌的有性繁殖器官，核配以后形成卵孢子進而產生下一代病原菌菌絲體。圖 5C 示菌絲側生的孢子囊結構，此孢子囊結構也稱為厚垣孢子，其具有抵抗惡劣或極端環境的能力。



3 討論

病原菌終極腐霉是全球性的重要植物病原菌，可引起多種農作物和經濟作物的病害，給國家造成巨大的經濟損失。終極腐霉侵染石斛屬植物的現象越來越普遍，目前國內外對終極腐霉的致病機制報道較少，侵染寄主的具體過程尚不明確，給該病原菌導致的病害的防治帶來了極大困難。以往的研究表明，終極腐霉能夠產生多種蛋白以及纖維素酶、同工酶等細胞壁降解酶，導致細胞壁的降解，從而引起胡蘿卜空斑癥的發生。本研究系統地研究了終極腐霉感染金釵石斛前后的形態學變化，由徒手切片以及掃描電鏡觀察推測，終極腐霉主要通過表皮、氣孔等結構進行機械穿透、形成附著胞以及類似吸盤等特殊形態結構并分泌降解酶破壞金釵石斛細胞的細胞壁及其內部結構，并在細胞間延伸侵染，使根、莖、葉組織嚴重破壞，進而蔓延發病。

植物病原菌侵染寄主是一個極其復雜的過程，在今后的研究中，利用膠體金標記技術及熒光標記技術系統地進行終極腐霉對金釵石斛不同器官致病性的細胞化學研究，以及深入探討終極腐霉與金釵石斛相互作用的分子機制，不僅有利于終極腐霉致病機制的揭示，同時為開發有效的真菌抑制劑提供重要的理論基礎。