自 1985 年 Ackerman 等首先用 2 細胞鼠胚來對實驗室進行質量控制 \\(quality control, QC\\), 鼠胚實驗 \\(mouse embryoassay, EMA\\) 已成為生殖醫學中心胚胎培養室質量評估 , 尤其是培養液質量檢測最為廣泛應用的方法［1］。而培養液對體外胚胎培養的重要性是不言而喻的 , 一種優化的培養系統可以支持胚胎在體外或移植后形成囊胚并繼而發育成胎兒［1, 2］。
旨在對新建 IVF 胚胎培養室進行質量控制 , 同時對培養液進行評估 , 在為將來開展人類胚胎體外培養時培養液的選擇使用上積累實驗數據 , 本院生殖中心 2014 年 9~12 月使用 3 種不同培養液對昆明系小白鼠進行胚胎體外培養 , 并對比分析了 3 個不同組別之間的 4 細胞胚胎、8 細胞胚胎、融合胚以及囊胚形成率?，F報告如下。
1 材料與方法
1. 1材料
1. 1. 1實驗動物7周齡雌性昆明系小白鼠\\(體質量30~35 g\\),10 周齡雄性小鼠 \\( 體質量 35~40 g\\), 均購自浙江中醫藥大學實驗動物中心 , 雌雄分籠飼養。
1. 1. 2藥物與試劑尿促性素 \\(HCG\\) 與絨促性素 \\(HMG\\) 均購自麗珠制藥廠。簡單培養液 EBSS 購自 SIGMA 公司 , 序貫培養液 G1 和 G2 以及配子處理液 G-GAMETE 購自 Vitrolife公司 , 序貫培養液 Quinn's1026 和 Quinn's1029, 人血清白蛋白 \\(HSA\\) 以及石蠟油均購自 SAGE 公司。培養液均添加10%HAS, 表面覆油后置于 37℃ , 6.0% 培養箱中平衡過夜。
1. 1. 3耗材與設備35 mm 培養皿及巴斯德管均購自美國FALCON 公司 , CO2氣體純度為 99.999%, 丹麥 IVFTECH 工作站 , 日本 OLYMPUS 解剖顯微鏡 , 美國 THEMRO 培養箱 , 德國LABTECH CO2濃度檢測儀 , 美國 SIGMA 培養箱專用溫度計。
1. 2實驗方法
1. 2. 1鼠胚獲取與培養雌鼠腹腔注射 10 IU 的 HMG, 48 h后再注射 HCG, 注射后立即將雌雄按 1∶1 的比例合籠 , 48 h后取胚。將孕鼠頸椎脫臼處死后用眼科剪取輸卵管放于覆油的 G-GAMETE 配子處理液中 , 用 1 ml 注射器針頭將輸卵管切割數次 , 擠出胚胎 , 再用拉細的巴斯德管將 2 細胞鼠胚收集并隨機分裝到覆油的 3 種不同培養液中 , 并置于培養箱中培養［3, 4］。當胚胎培養到 8 細胞階段 , A 組將胚胎轉移到新配制并于前 1 d 過夜平衡后的 EBSS 培養液 , B、C 組則分別將胚胎從 G1 和 Quinn's1026 培養液中轉移到經過夜平衡后的 G2 和 Quinn's1029 培養液中繼續培養。
1. 2. 2鼠胚的觀察觀察并記錄 24 h 后 4 細胞胚胎形成率 ,48 h 后 8 細胞或融合胚形成率 , 72 h 后囊胚形成率。
1. 3統計學方法采用 SPSS19.0 統計學軟件對數據進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。
2 結果
在 2014 年 9~12 月本院新建 IVF 胚胎實驗室共進行 7個周期的鼠胚體外培養實驗 , 累計獲取 2 細胞胚胎 534 枚 ,其中形成囊胚 382 枚 , 總體囊胚形成率為 71.54%。鼠胚培養分成 3 個組別進行 , A 組使用 EBSS\\(Earle's Balanced SaltSolution\\) 簡單培養液 , 在所獲得的 72 枚 2 細胞胚胎中共有22 枚最終發育成囊胚 , 囊胚形成率為 30.56% ；B 組使用 G1和 G2 序貫培養液 , 183 枚 2 細胞胚胎中 , 129 枚發育成囊胚 ,形成率為 70.49% ；C 組使用 Quinn's1026 和 Quinn's1029 序貫培養液 , 所得 279 枚胚胎中有 231 枚發育到囊胚階段 , 其形成率為 82.80%。B 組和 C 組的囊胚形成率顯著高于 A 組\\(P<0.01\\), 三組的胚胎發育情況及囊胚形成率 , 見表 1。鼠胚于覆油 35 mm 皿中體外培養不同時期的生長情況 , 見圖 1?！?】
3 討論
實驗室質控對試管嬰兒結局有重要影響。體外一系列因素如溫度、濕度、塵埃、揮發性有機物 \\(VOC\\)、震動、噪音、光照、CO2濃度、pH、滲透壓等都會對不具備任何屏障和保護功能的胚胎產生影響［1］。因此 , 建立穩定可靠的試管嬰兒實驗室 , 為胚胎發育提供相對穩定的場所 , 維持試管嬰兒成功率顯得尤為重要。而在諸多影響胚胎發育的因素中 , 培養液是直接和胚胎接觸的介質 , 同時也是實驗室最常用及最重要的消耗品 , 其穩定性直接決定著胚胎培養的結局。小鼠胚胎生物檢測 \\(MEA\\) 是目前廣泛用于新建或新啟動周期的試管嬰兒實驗室的質控方法 , 尤其在評估培養液的質量上發揮重要作用。
為了檢測新建試管嬰兒胚胎培養室是否達到人類胚胎培養標準 , 同時為今后開展試管嬰兒胚胎體外培養在培養液的選擇使用上積累實驗數據 , 本院生殖中心 2014 年 9~12 月 ,分別用 EBSS, G1/G2, Quinn's1026/1029 對小鼠胚胎進行了體外培養 , 并進行了對比分析。鼠胚發育的結果顯示 , 在囊胚形成率上 , 使用序貫培養液 G1/G2, Quinn's1026/1029 進行培養的鼠胚的囊胚形成率 \\(70.49%, 82.80%\\) 要顯著高于使用簡單培養液EBSS的囊胚形成率\\(30.56%\\)。而在胚胎發育過程中,作者發現使用簡單培養液EBSS進行培養的胚胎在發育到4-5細胞階段發生了較為嚴重的阻滯 , 24 h 后 4-5 細胞的形成率為 51.39%\\(37/72\\), 而發育到囊胚階段僅有 30.56%\\(22/72\\), 而使用序貫培養液的胚胎則未發生此種現象。這可能是因為序貫培養液應對胚胎在卵裂早期和晚期對能量物質和氨基酸在需求上的不同做了成分上的調整 , 從而使得胚胎在代謝活動相對較弱的早期和代謝活動相當活躍的囊胚階段都得到了合適的物質及能量支持 , 如在卵裂階段 , G1/G2, Quinn's1026/1029均不含必須氨基酸 , 但到了囊胚階段必須氨基酸的含量則遠高于非必須氨基酸的含量 , 而簡單培養液的一個很大的不足是其不含氨基酸等復合成分 , 使得其不能對胚胎發育階段的改變做出調整 , 致使胚胎發育停滯在 4-5 細胞階段。而在兩種序貫培養液之間的比對上 , 作者發現同樣添加 10% 人血清白蛋白 HSA 后 , 在囊胚的形成率上使用 SAGE 系列的Quinn's1026/1029\\(82.80%\\) 要高于使用 Vitrolife 系列的 G1/G2\\(70.49%\\), 而美國梅奧醫學中心的 Morbeck 等［5, 6］最近在Fertility and Sterility 的研究報告顯示添加 HSA 的 SAGE 系列序貫培養液的鼠胚囊胚形成率 \\(75%\\) 反而略低于添加 HSA的 Vitrolife 系列序貫培養液的培養結果 \\(78%\\)。G1/G2 和Quinn's1026/1029 在葡萄糖、有機酸、乳酸、丙酮酸、氨基酸、金屬離子和無機鹽等成分的比例上都存在一定的差異 ,會對胚胎培養產生不同的影響。與此同時 , 不同的小鼠種系 ,促排卵藥物的種類與劑量以及培養環境、培養油、培養用器皿、培養箱、培養方法和操作過程都有可能對胚胎的發育結局產生影響。而培養液在小鼠胚胎體外培養的效果也不完全等同于其他種系胚胎培養的效果。但通過本次實驗 , 更加確定了序貫培養液 G1/G2 和 Quinn's1026/1029 在鼠胚體外培養效果上要優于早期簡單培養液 EBSS, 實驗同樣豐富了對兩種序貫培養液 G1/G2 和 Quinn's1026/1029 的認識。
參 考 文 獻
［1］ 黃國寧 , 孫海翔 . 體外受精 - 胚胎移植實驗室技術 . 北京 : 人民衛生出版社 , 2012:15 -37.
［2］ 黃國寧 , 劉東云 , 韓偉 . 輔助生殖技術實驗室的建設及其質量控制 . 中國實用婦科與產科雜志 , 2010, 26\\(10\\):755-758.
［3］ 王利紅 , 連方 . 兩種 2- 細胞鼠胚體外培養方法比較 . 中國比較醫學雜志 , 2009, 19\\( 11\\): 67-69.
［4］ 孫新明 , 魏泓 , 趙永聚 , 等 . 昆明小鼠成熟卵母細胞體外授精及受精卵體外培養的研究 . 中國比較醫學雜志 , 2005, 15\\(3\\):129-132.
［5］ Morbeck DE. Importance of supply integrity for in vitro fertilizationand embryo culture. Semin Reprod Med, 2012, 30\\(3\\):182-190.
［6］ Morbeck DE, Krisher RL, Herrick JR, et al. Composition ofcommercial media used for human embryo culture. Fertil Steril,2014, 102\\(3\\):759-766.
