乳腺發育過程涉及許多種細胞的參與及協同作用。乳腺細胞內大分子成分主要有糖類、脂類和蛋白質等三大類，它們也是乳汁主要組成成分。乳汁是乳腺生理活動的產物，乳汁中含有初生幼仔生長發育所必需的營養物質。乳汁成分復雜，都含有水、蛋白質、脂肪、糖、無機鹽等。

季節、年齡、胎次、泌乳期、個體特性等，都能影響乳汁成分。乳中的蛋白質主要包括3類，即酪蛋白、乳清蛋白和微量蛋白。它們除能供給機體營養，還具有保護、物質運輸、控制代謝、輸送氧氣、防御病菌的侵襲、傳遞遺傳信息等功能。乳中脂類主要是三酰甘油，約占乳脂的98%。乳中無機鹽有主要包括鈉、鉀、鈣、鎂的氯化物，磷酸鹽、鐵等。這些物質在乳中的含量有很大差異，在體內都各自具有特殊的生理功能，缺乏時常引起特殊疾病。

本研究采用經典組織化學方法結合生物顯微圖像分析軟件，系統地對不同發育時期中國荷斯坦牛乳腺中大分子成分變化進行分析，可有效提高乳產量和質量。為進一步研究中國荷斯坦牛的泌乳機制及其泌乳機能分化規律和選育優良性狀提供形態學資料與理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物

試驗動物來自于黑龍江?。▏壹墸┬竽翗I科技園區。選取健康雌性中國荷斯坦牛30頭。檢測無乳腺炎及其他疾病。采樣時點為：青春期360、420d；妊娠期60、180、260d；泌乳期7、60、280d；退化期3、30d，共計10個時點。每個采樣時點選取3只奶牛作平行，每次試驗至少重復3次。奶牛處死后，用滅菌手術刀分離乳腺組織，立即置于10%甲醛水溶液固定備用。

1.1.2樣品采集與制備

乳腺組織采集后，迅速轉入凍存管中，液氮凍存后轉入-80℃冰箱備用。將固定好的各時期組織塊修整標號后，用流水沖洗后，乙醇梯度脫水，丙酮、二甲苯透明；56℃蠟箱浸蠟，石蠟包埋，修塊；切片（4~5μm）、展片、粘片、烘干備用。

1.2方法

1.2.1過碘酸-Schiff反應（PAS）顯示乳腺中糖類的變化

將標記好的乳腺組織冰凍切片用過碘酸水溶液處理；染色、漂洗、復染、梯度脫水、封片。顯微鏡觀察、照像。對照片不經過碘酸處理，直接進入染色流程，則反應呈陰性或明顯減弱。

1.2.2油紅O染色法顯示乳腺中脂類的變化

取標記好的乳腺組織冰凍切片固定、漂洗、油紅O染液浸染、復染、封片。顯微鏡觀察、照像。

1.2.3茚三酮-Schiff反應顯示乳腺中蛋白質的變化

將標記好的乳腺組織冰凍切片固定、置入0.5%茚三酮液中處理、切片取出后流水沖洗、染色、漂洗、沖洗、復染、1%鹽酸酒精分化流水沖洗、梯度脫水、封片。顯微鏡觀察、照像。對照片不經茚三酮液處理，直接進入Schiff試劑染色流程，則反應呈陰性或明顯減弱。

1.2.4圖像采集、處理與分析

本研究應用LeicaDLMB-2顯微鏡觀察、照像，每個重復3次，每張切片選取5個視野觀察，最后用Image-proplus6.0軟件對采集的圖像進行處理與分析。

2、結果與分析

2.1過碘酸-Schiff反應（PAS）顯示乳腺中糖類的變化

青春期中國荷斯坦牛乳腺內分布許多導管，紫色信號大都分布在導管周圍的結締組織中，此時乳腺內糖類主要為糖蛋白和蛋白聚糖（見圖1a，圖1b）。妊娠60日，PAS陽性信號大多出現在腺泡間的結締組織中，但腺泡和小葉間結締組織明顯變?。ㄒ妶D1c）。妊娠180日，PAS陽性仍主要出現在結締組織中，腺泡腔內陽性信號很難判斷（見圖1d）。妊娠260日，整個腺泡腔因為分泌物的增加而膨脹變大，腺泡腔部分內容物呈現紫色的PAS陽性反應。小葉間結締組織中陽性信號明顯，但面積逐步減少（見圖1e，圖1f）。泌乳期乳腺的發育分化完全，腺泡上皮細胞分泌特征明顯，腺體的大部分都是充盈飽滿的腺泡腔（見圖1g，圖1h）。腺泡腔中內容物的PAS陽性信號非常強（見圖1i，圖1j）。乳腺進入退化期，腺泡上皮細胞逐漸凋亡，其泌乳活動也逐步停止。退化3日，逐漸萎縮的腺泡腔內還可見明顯減弱的PAS陽性信號，結締組織中陽性信號逐步增強（見圖1k）。退化30日，只有小部分殘留的腺泡腔內還可見較弱的PAS陽性信號，腺泡腔內主要為大的脂肪顆粒，結締組織中陽性信號進一步增強擴大，PAS陽性信號大多分布在乳腺間質中（見圖1l）。

2.2油紅O染色法顯示乳腺中脂類的變化

青春期乳腺，乳導管開始生長逐漸延伸變厚且分支增多，外面包圍著很厚的小葉間結締組織，逐漸侵入脂肪組織。橙色著染的空泡狀的大脂肪細胞是青春期乳腺的主體結構（見圖2a，圖2b）。妊娠期乳腺最顯著的變化就是腺泡腔逐漸出現，小葉內腺泡數量逐漸增多，大脂肪細胞逐漸消失。妊娠180d時大脂肪細胞完全消失（見圖2c，圖2d）。到妊娠260d時腺泡上皮細胞內出現大量脂滴，并有少量脂滴分泌至腺泡腔內（見圖2e，圖2f）。泌乳期乳腺發育分化完全，大量的脂滴從腺泡上皮細胞內泌至腺泡腔，使腺泡腔變得充盈飽滿（見圖2g，圖2h，圖2i，圖2j）。乳腺進入退化期時脂肪組織發生劇烈的變化。退化3d時只有腺泡上皮細胞內有脂滴，腺泡腔里則沒有（見圖2k）。退化30d，腺泡的大小和輪廓出現劇烈變化，形狀變得不規則，小葉間結締組織密度增加，脂滴相互融合形成大的空泡狀脂肪細胞。

脂肪細胞重新分化，并與結締組織一起圍繞著重組后明顯減少和縮小的腺泡結構（見圖2l）。完全退化的乳腺主要由脂肪細胞組成，腺體重新呈現成熟未妊娠狀態。

2.3茚三酮-Schiff反應顯示乳腺中蛋白質的變化

青春期乳腺大部分都是以脂肪和結締組織，乳腺實質部分較少。光鏡下可見紫紅色的陽性信號大都分布在導管周圍的結締組織中（見圖3a，圖3b）。妊娠期乳腺加速生長分化，腺泡上皮細胞快速增殖。腺泡結構日趨成熟，腺泡腔出現并逐漸變大，但在妊娠60d，紫紅色的陽性信號大都分布在腺泡芽周圍的結締組織中（見圖3c）。妊娠180d，陽性信號仍大都份出現在小葉間結締組織中，腺泡腔逐漸擴大，腔內可見微弱陽性信號（見圖3d），直到妊娠260d，腺體內出現成熟獨立的腺泡。腺腔內可見強烈的紫紅色陽性信號，腺泡腔逐漸膨脹飽滿（見圖3e，圖3f）。泌乳期乳腺內布滿分化完全的成熟腺泡結構，腺體的大部分都是充盈的腺泡腔，腺泡腔內呈現紫紅色陽性信號，腺泡上皮細胞分泌活動旺盛（見圖3g，圖3h，圖3i，圖3j）。

乳腺進入退化期后，腺泡上皮細胞開始凋亡，泌乳活動也逐步停止。退化3d結締組織中陽性信號逐漸增強，縮小變形的腺泡腔內有減弱的陽性信號（見圖3k）。退化30d，脂肪組織和結締組織等間質大量增生，結締組織中陽性信號進一步增強擴大，只有部分殘留的腺泡腔內還可見較弱陽性信號，腺泡腔內主要為大的空泡狀脂肪顆粒。腺泡結構已基本消失，陽性信號大多分布在乳腺間質中（見圖3l）。

3、討論

3.1乳腺中糖類的變化規律

乳腺中的糖類主要包括乳糖和糖復合物。乳糖是乳中糖類的主要組成成分，乳糖是牛奶中最為豐富的糖類，不同動物乳中的乳糖含量不同，牛乳中糖類有99.8%是乳糖。顯示糖類最常用的組織化學方法是過碘酸-Schiff反應（PAS）。過碘酸-Schiff反應（PAS）的反應基礎是利用過碘酸的氧化作用，過碘酸把糖類相鄰兩個碳上的羥基氧化成醛基，醛基再與Schiff試劑中的堿性品紅形成紫色化合物，達到染色目的。

PAS反應同樣對含有CHOH-CO、CHOH-COOH、CHOH-CHNH2的糖蛋白、蛋白聚糖等大分子具有氧化作用，釋放醛基。值得注意的是過碘酸和Schiff試劑濃度、作用時間、pH、溫度等對PAS結果的強度都會有所影響。青春期乳腺導管系統雖已形成，但乳腺基本不發育。本研究中乳腺內分布著許多導管，紫色的PAS陽性信號大都分布在導管周圍，此時乳腺內糖類主要為糖蛋白和蛋白聚糖等糖復合物，說明乳腺間質大量增生，腺體內主要以脂肪和結締組織為主。妊娠期初期乳腺內腺泡腔開始出現，PAS陽性信號大多出現在腺泡間的結締組織中，表明此時乳腺內糖類仍主要為糖復合物。但腺泡和小葉間結締組織明顯變薄，說明此時期腺泡芽大量增生，乳腺間質逐步減少。妊娠中期腺泡逐漸發育，腺泡腔逐漸擴大，PAS陽性信號顯示的仍主要為結締組織中的糖蛋白和蛋白聚糖。盡管有報道顯示合成乳糖所需酶在妊娠中期已出現，但本研究中很難判斷此時有乳糖的表達，即便有分泌也是微量。而到妊娠260d腺泡分泌特性明顯，腺泡腔部分內容物呈現紫色的PAS陽性反應，表明此時期乳腺內糖類主要為腺泡腔內的乳糖。糖蛋白和蛋白聚糖成分陽性信號明顯，但面積逐步減少。泌乳期乳腺腺泡腔內有大量乳糖顆粒堆積，腺泡腔內容物的PAS陽性信號要強于妊娠晚期，表明乳糖的分泌表達逐漸達到頂峰。乳腺進入退化期后，腺泡上皮細胞的泌乳活動也逐步停止。

退化3d乳腺內腺泡腔內容物的PAS陽性信號強度逐漸降低，表明乳糖分泌隨泌乳活動逐步停止。

同時結締組織中糖蛋白和蛋白聚糖成分陽性信號逐步增強，表明乳腺間質逐漸增生。退化30d腺體內腺泡結構基本消失，PAS陽性信號大多分布在增生乳腺間質中，此時乳腺內糖類與青春期基本一致，主要為糖復合物。

3.2乳腺中脂類的變化

中脂類可分為貯存脂（Storagelipid）和結構脂（Structurallipid）。乳腺中貯存脂為三酰甘油，它是乳脂主要組成，主要貯存在脂肪細胞內。乳腺中的結構脂包括糖脂、磷脂、固醇，它們是構成各種生物膜的脂雙層骨架。在乳腺發育過程中腺泡上皮組織和脂肪組織變化最大。油紅O為脂溶性染料，在脂肪內能高度溶解，可特異性的使組織內甘油三酯等中性脂肪著色。本研究采用油紅O染色和細胞核復染定位法檢測中國荷斯坦牛乳腺組織，在細胞水平觀察乳腺發育中脂類的產生和表達變化情況。

本研究中青春期中國荷斯坦牛乳腺絕大部分都為脂肪組織，富含三酰甘油的空泡狀大脂肪細胞被油紅O染成橙色。乳腺進入妊娠期后，隨著腺泡的逐步發育分化，大脂肪細胞逐漸消失，妊娠60d中國荷斯坦牛乳腺只有很少量的大脂肪細胞。

妊娠180d時大脂肪細胞完全消失，腺泡上皮細胞內出現大量脂滴，并有少量脂滴分泌至腺泡腔內。泌乳期乳腺發育分化完全，大量脂滴從腺泡上皮細胞內分泌至腺泡腔形成乳脂，使腺泡腔便道充盈飽滿。有研究顯示此時約30％腺體仍分布有脂肪細胞，且一部分為多泡脂肪細胞，可能要歸因于腺泡上皮細胞利用脂肪而引起的脂肪動員。乳腺進入退化階段，脂肪組織發生劇烈變化。退化3d乳腺內只有腺泡上皮細胞內存有脂滴，腺泡腔則沒有。此后腺體內脂滴開始相互融合形成大的空泡狀脂肪細胞。退化30d脂肪細胞重新分化，完全退化的乳腺內主要由大的空泡狀脂肪細胞組成，腺體重新呈現性成熟未妊娠狀態。

研究表明，作為乳腺形態形成的最后一個階段，腺泡發育過程與乳腺泌乳機能的分化過程相互交叉密不可分。小鼠乳腺泌乳機能的分化可分為兩個階段，第一階段在妊娠中期開始，各種乳蛋白基因持續表達，合成增加，如乳清蛋白、β-酪蛋白等，這階段在形態學上表現為腺泡上皮細胞內出現大量脂滴；第二階段在分娩前后，各種乳蛋白基因繼續高表達而在形態學上的表現為腺泡上皮細胞間連接更加緊密，腺泡上皮細胞內的脂滴和酪蛋白分泌至腺泡腔內。本研究結果顯示中國荷斯坦牛乳腺泌乳機能分化的第一階段始于妊娠晚期，第二階段發生在分娩后泌乳開始。這一結果與關中奶山羊乳腺發育與泌乳機能分化過程相似，這也從形態學上證明，反芻類動物乳腺泌乳機能的分化與嚙齒類動物存在一定的差異。

3.3乳腺中蛋白質的變化

本研究中青春期和妊娠期初期中國荷斯坦牛乳腺內，紫紅色的陽性信號大都分布在導管和腺泡芽周圍的結締組織中，此時乳腺內蛋白質主要為糖蛋白和蛋白聚糖，這也表明此時期腺體內以乳腺間質為主，乳腺上皮細胞較少。妊娠中期，腺泡腔逐步擴大，陽性信號仍大都份顯現于小葉間結締組織中，但腺泡腔內可見微弱陽性信號，表明此時期乳腺內蛋白質主要仍為糖蛋白和蛋白聚糖，同時有少量乳蛋白分泌表達。而在妊娠晚期，整個腺泡腔內均呈現紫紅色的陽性信號，說明此時期隨著腺泡分泌活動的增強，乳腺內蛋白質逐漸以乳蛋白為主。這種現象貫穿整個泌乳期。退化3d腺泡腔內陽性信號強度逐漸降低，同時間質中陽性信號逐步增強，表明乳蛋白的分泌逐步減弱，乳腺間質逐漸增生。退化30d腺體內陽性信號大多分布在增生的乳腺間質中，此時乳腺內蛋白質表達基本恢復到妊娠前狀態，主要為糖蛋白和蛋白聚糖。

4、結論

a.中國荷斯坦牛乳腺發育過程中青春期乳腺主要為富含三酰甘油的脂肪組織，妊娠期和泌乳期，大脂肪細胞逐漸消失，大量脂滴逐漸出現。退化期腺體內脂滴開始相互融合成大的空泡狀脂肪細胞，重新呈現成熟未妊娠狀態。

b.中國荷斯坦牛乳腺發育過程中，青春期、妊娠初中期和退化期乳腺中的糖類以糖蛋白和蛋白聚糖為主，妊娠晚期和泌乳期以乳糖為主。

c.中國荷斯坦牛乳腺發育過程中乳腺中的蛋白質以糖蛋白和蛋白聚糖為主；妊娠中晚期和泌乳期以乳蛋白為主。