研究發現，糖尿病患者較正常人更易于發生骨量減少和骨質疏松癥。其發生機理至今尚未明確，多項臨床研究顯示，與持續性高血糖相比，間歇性高血糖對糖尿病患者的微血管及大血管損傷更為顯著，并可增加心血管死亡風險。

然而，間歇性高血糖對成骨細胞乃至骨的影響，目前尚無相關研究。因此，本實驗中我們以小鼠顱骨成骨細胞為研究對象，研究間歇性高糖環境對于成骨細胞的形態、細胞增殖及功能蛋白表達的影響。

1、對象與方法

1.1實驗對象

取出生3日內的健康新生KM小鼠（購自福建醫科大學動物實驗中心），拉頸處死，75%酒精中浸泡20min后，取出顱骨，剔除附著于顱骨上的結締組織及骨膜，PBS沖洗至其呈白色后，用眼科剪將顱骨剪碎成1mm×1mm×1mm的碎骨片，將其用0.25%胰蛋白酶于37℃恒溫下消化10min，吸棄消化液，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶中37℃消化20min，收集消化液，重復3次。將消化液置于離心管中，1500r/min離心8min，去上清，所得白色沉淀即為成骨細胞。加入含有15%胎牛血清與1%雙抗的HDMEM培養基重懸細胞，將其接種于培養瓶中。細胞在37℃、5%CO2、95%O2、100％濕度的孵箱中培養。根據細胞生長情況以及培養液pH值變化選擇2～3天換液一次，待細胞80％～90％融合時傳代，傳代后，改用含有10%胎牛血清與1%雙抗的LDMEM培養基培養細胞。BCIP/NBT堿性磷酸酶染色鑒定成骨細胞，細胞傳代接種。

對數生長期的第3代成骨細胞隨機分為3組：5.5mmol/L正常糖濃度組、25mmol/L持續性高糖組、5.5mmol/L～25mmol/LQD間歇性高糖組，分別檢測干預1w、2w及3w后成骨細胞形態學變化，收集上清液OCN及ALP分泌情況取第三代成骨細胞，調整細胞終密度為5000個/孔，細胞接種于96孔板中，共設四塊平行培養板置培養箱中培養24h，觀察大部分細胞已經貼壁，吸棄培養基。將細胞分成上述3個組，每個濃度組設5個重復孔（含不同糖濃度培養基、含細胞）和3個空白孔（即只含培養液、不含細胞），培養液總體積均為200μL/孔，培養48h、72h后，每孔避光加入20μLMTT溶液，37℃繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結晶物溶解，于490nm波長處測定各孔吸光度（OD）值，取平均值。

1.2實驗方法

用放射免疫法（RIA）檢測細胞上清液中骨鈣素含量，比色法檢測細胞上清液中堿性磷酸酶（ALP）的含量。

1.3統計學分析

所得數據均采用SPSS17.0軟件系統分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，對符合正態分布的計量資料，組間指標的比較均采用獨立樣本的t檢驗。對非正態分布的資料，進行對數轉換，若無法轉換，則采用非參數秩和檢驗進行組間比較，以P＜0.05為差別有顯著性意義。

2、結果

2.1不同糖濃度環境對成骨細胞形態學的影響在正常糖濃度環境下，各組成骨細胞形態未見明顯變化（圖1A）。在高糖環境下，隨著干預時間的延長，細胞形態逐漸出現變異，以3w組最為明顯。間歇性高糖組（圖1C）較正常糖濃度組及持續性高糖組（圖1B）細胞生長能力明顯減弱，細胞間連接融合減少，部分細胞呈多角形，細胞漿內顆粒增多，細胞核邊緣模糊，部分核已裂解?？梢姴糠旨毎摫谄?。

2.2MTT法檢測不同糖濃度環境下成骨細胞增殖能力的影響成骨細胞在正常糖濃度、持續性高糖環境及間歇性高糖環境（Q12H波動）下干預48h和72h后的OD值如表1所示。在相同干預時間點，間歇性高糖組OD值明顯低于正常糖濃度對照組及持續性高糖組，差異有具有統計學意義（P＜0.05），并且隨著干預時間的延長，各組OD值呈下降趨勢，組間兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3不同糖濃度環境對成骨細胞OCN和ALP分泌的影響分別用正常糖濃度、持續性高糖、間歇性高糖（QD波動）培養基干預1w、2w和3w后收集各組細胞培養上清液，檢測各干預組細胞OCN和ALP的分泌量，分別采用所測得上清液中OCN或ALP濃度/細胞總蛋白之比表示，結果如表2所示。

（1）比色法檢測ALP濃度結果顯示，在相同干預時間點，高糖組細胞上清液ALP分泌量低于正常糖濃度組（P＜0.05），并且間歇性高糖組ALP分泌量降低更顯著，組間兩兩比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。隨著干預時間的增加，在高糖組中，相同糖環境組上清液ALP分泌量逐漸減少，而正常糖濃度組ALP分泌量逐漸增加（P＜0.05）。

（2）采用放射免疫法檢測OCN濃度結果顯示，在相同干預時間點，高糖組的OCN分泌量低于正常糖濃度組（P＜0.05），并且間歇性高糖組OCN分泌量降低更顯著，組間兩兩比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。隨著干預時間的增加，在高糖組中，相同糖環境組上清液OCN分泌量逐漸減少，而正常糖濃度組OCN分泌量逐漸增加（P＜0.05）。

3、討論

近年來，糖尿病和骨質疏松癥的聯系受到廣泛關注，研究認為成骨細胞功能受損是糖尿病骨質疏松及骨折風險增加的主要原因，糖尿病患者在其治療過程中，由于血糖控制不佳及不恰當的使用降糖藥物，常常出現餐后高血糖或藥物性低血糖，而胰島細胞及胰島素靶器官因功能障礙不能對血糖的變化進行反饋調節，使血糖在較大范圍內波動。長期暴露在持續性高血糖中，可使各組織和細胞發生適應性調節而產生耐受，而間歇性高血糖抑制了適應性的產生，從而造成更為嚴重的損害。我們的前期研究已經證實，持續性高糖環境可抑制成骨細胞增殖并促進其凋亡，本研究進一步觀察不同高糖干預模式對成骨細胞增殖能力及功能的影響，發現間歇性高血糖對成骨細胞增殖的抑制作用比持續性高糖更為顯著，細胞生長及細胞形態變異更為顯著，且這一抑制作用表現出時間依賴性。血糖波動通過影響成骨細胞分化、增殖從而影響骨代謝，可能是是糖尿病易發骨質疏松癥的發病機制之一。

在成骨細胞的功能方面，檢測ALP和OCN。ALP是反映骨形成的指標，OCN主要反映成骨細胞的分化和成熟，在成骨細胞分化后期和礦化期表達增高。新近臨床研究及動物試驗均表明，盡管OCN是成骨細胞分泌的特異性蛋白，但其與糖脂代謝密切相關，包括促進小鼠胰島細胞增殖及胰島素的釋放、增加脂肪組織的分解以及促進脂肪因子的釋放，并與胰島素敏感性呈正相關，日本2013年4月開展的一項研究表明，OCN水平不僅與糖脂代謝相關，甚至與男性腹主動脈鈣化存在相關性。因此，OCN是骨代謝與糖脂代謝相關性疾病之間的橋梁，在預防代謝性疾病的發生過程中起到重要作用。本實驗中運用不同糖環境培養基干預1w、2w和3w后，高糖組成骨細胞上清液中ALP和OCN的蛋白表達情況明顯低于正常糖濃度組，其中間歇性高糖組降低更為顯著。隨著干預時間的延長，正常糖濃度組成骨細胞ALP和OCN的分泌量逐漸增加，而高糖組則逐漸減少，間歇性高糖組減少更為顯著?？梢?，與持續性高糖相比，間歇性高糖對成骨細胞的損傷更為嚴重，能夠進一步抑制ALP和OCN的分泌、成骨細胞增殖，導致成骨細胞數量減少，功能受損，是導致糖尿病性骨質疏松的一項重要原因。

綜上所述，間歇性高糖對成骨細胞產生毒害作用可能與抑制成骨細胞增殖并減少成骨細胞特異型蛋白如ALP和OCN的表達有關，而這一糖毒性作用較持續性高糖環境更為明顯，并呈現出時間依賴性。