近年來，老年人學習記憶能力減退相關疾病的發生率逐年上升，已引起了國內外的廣泛關注。

Floyd 等研究發現，活性氧自由基\\( reactive oxygenspecies，ROS\\) 的增加與衰老的進程及老齡化過程中認知功能的退化密切相關。大量研究結果已經證實，長期適宜強度運動可以降低氧化應激相關疾病的危險性，且可以抵抗老齡化導致的認知功能減退，這一現象在人及動物模型中已經得到廣泛驗證。盡管有氧運動改善腦組織氧化應激水平進而改善認知功能的現象不斷得到證實，但有氧運動改善腦組織氧化應激水平的確切機制仍然沒有完全闡明。過氧化物酶體增殖活化受體 γ 輔助活化因子1α\\( Peroxisome proliferator － activated receptor gammacoactivator 1 － alpha，PGC － 1α\\) 是 ROS 新陳代謝的重要調解因子，而 AMP 激活蛋白激酶\\( AMP － acti-vated protein kinase，AMPK\\) 則是調解 PGC － 1α 磷酸化的一種蛋白激酶，其表達變化可對 PGC －1α 表達產生重要影響。在肌肉組織內，AMPK 及 PGC －1α表達的變化對改善肌肉組織氧化應激水平具有重要調控作用。但在腦組織內，有氧運動是否通過改善以上蛋白表達而達到了改善氧化應激水平的目的，目前尚未見到相關報道。為此，研究對 8 周有氧運動老年大鼠海馬 ROS 水平、抗氧化物酶活性\\( 超氧化物歧化酶\\( superoxide dismutase，SOD\\) 、谷胱甘肽過氧化物酶\\( glutathione peroxidase，GPx\\) \\) 、脂質過氧化產物\\( 丙二醛，malondialdehyde，MDA\\) 、PGC－ 1α 及 AMPK 表達水平進行了檢測，旨在探討有氧運動改善海馬組織氧化應激水平的機制，進而為揭示有氧運動抵抗老齡人口認知功能減退的相關機制提供實驗依據和數據支持。

1 材料與方法

1． 1 實驗動物及分組
實驗選用鼠齡為 24 月的健康雄性 Wistar 大鼠，體質量為\\( 340 ±20\\) g，常規分籠飼養，自由進食飲水，自然光照，動物房內溫度\\( 20 ± 3\\) ℃，相對濕度為 40% ～ 60%。動物隨機分為空白對照組\\( CG\\) 、運動組\\( EG\\) ，每組 8 只，共 16 只。

1． 2 大鼠有氧運動方案
運動組大鼠先進行一周的適應性跑臺訓練\\( 隔天 1 次，共 3 次\\) ，速度 10 m/min，每次 15 min。適應性訓練后，未見不良反應的大鼠于 24 h 后進行正式實驗。大鼠有氧運動方案采用修改后的 Bedford遞增負荷跑臺運動方案。運動組大鼠共進行8 周有氧跑臺訓練，每周 5 次，訓練均安排在每周的周一至周五晚間進行，運動負荷如表 1 所示。

1． 3 樣本的制備
最后一次運動 24 h 后，用 2% 戊巴比妥鈉\\( 3mL / kg\\) 腹腔麻醉大鼠，斷頭取腦，冰玻片上迅速剝離出兩側海馬，－80 ℃冰箱保存待測。1． 4 ROS、SOD、GPx 及 MDA 含量的測定采用化學熒光法對大鼠海馬 ROS 含量進行測定。取大鼠海馬 0． 1 g，按質量\\( g\\) ∶ 體積\\( mL\\) =1∶ 20 的比例加入勻漿介質 \\( 100 mmol / L 磷酸緩沖液\\) ，冰水浴條件下機械勻漿，1 000 g 離心 10 min，取部分上清采用考馬斯亮藍法對其進行蛋白定量檢測\\( A045 －2 試劑盒，南京建成\\) 。另取勻漿上清液加入熒光探針\\( E004，南京建成\\) ，37 ℃孵育30 min，對其熒光強度進行測定\\( 激發波長 500 nm，發射波長 525 nm\\) ，測定結果以熒光強度/毫克蛋白表示。

大鼠海馬 SOD、GPx 及 MDA 的含量采用相應試劑盒進行檢測\\( 南京建成\\) ，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行?！颈?】


1． 5 PGC － 1α 及 AMPK 的測定大鼠海馬 PGC －1α 及 AMPK 的測定
采用 west-ern blot 方法進行，實驗過程如下: 取適量海馬勻漿處理后加入裂解液\\( 包含 137 mM Nacl，20 mM Tris－ HCl pH 8． 0，2% Nonidet P － 40，10% 甘油及蛋白酶抑制因子\\) ，將其超聲處理 30 s 后，4 ℃環境下 15300 g 離心 15 min，收集上清，采用 BCA 蛋白定量方法測定總蛋白濃度，分裝，于 － 80 ℃保存待測。取20 μg 蛋白進行 SDS － PAGE 凝膠電脈\\( 8 ～ 12% ，V /V\\) ，PVDF 膜轉印，5% 脫脂奶粉封閉 \\( 室溫，2 h\\) 。

加入經過 TBS － T 緩沖液稀釋的一抗\\( PGC － 1α，1∶ 1 000，貨號 13067，Santa Cruz Biotechnology，美國;AMPK，1∶ 2 000，貨號 2532，Cell Signaling Technolo-gy，美國\\) ，4 ℃ 過夜后，將膜放入 TBS － T 緩沖液進行沖洗，加入 HRP 標記二抗，室溫孵育 1 h，TBS － T緩沖液中反復沖洗之后，與增強化學發光劑孵育。

在暗室中使用 X 膠片曝光，顯影，定影后觀察結果。使用 Quantity one \\( Bio － Rad\\) 軟件對目的蛋白和內參蛋白進行光密度分析，以 actin 蛋白為內參。目的蛋白相對含量 = 目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1． 6 統計學處理
所得數據均用平均數標準差\\( x ± s\\) 表示，利用SPSS10． 0 對所有數據進行處理并進行獨立樣本 T檢驗，P ＜ 0． 05 表示差異顯著。

2 研究結果

2． 1 不同組別大鼠海馬 ROS 含量的比較
如圖 1 所示，8 周有氧運動訓練使大鼠海馬ROS 含量較對照組顯著降低\\( P ＜ 0． 05，相對濃度分別為 0． 69 ±0． 03 和 0． 39 ±0． 02\\) ，提示有氧運動訓練可顯著減少海馬活性氧自由基水平?！緢D1】


2． 2 不同組別大鼠海馬 SOD 及 GPx 活性的比較
實驗結果發現\\( 見圖 2 － A 及圖 2 － B\\) ，運動訓練組大鼠海馬 SOD 及 GPx 活性較對照組均顯著上升\\( P ＜ 0． 05\\) ，運動組與對照組 SOD 活性分別為\\( 88． 07 ± 7． 46\\) U/mgprot 及\\( 105． 03 ± 15． 17\\) U/mgprot; GPx 活性分別為\\( 2． 83 ± 0． 42\\) U / mg prot 及\\( 4． 37 ±0． 73\\) U/mg prot\\) ?！緢D2】

2． 3 不同組別大鼠海馬 MDA 含量的比較
實驗結果發現\\( 見圖 3\\) ，對照組大鼠海馬 MDA含量為\\( 3． 09 ±0． 41\\) U/mgprot，而運動訓練組含量為\\( 1． 51 ±0． 34\\) U/mgprot，兩組間呈現差異顯著\\( P＜ 0． 05\\) ，提示長期有氧運動訓練可顯著降低海馬脂質過氧化損傷水平?！緢D3】

2． 4 不同組別大鼠海馬 PGC － 1α 表達的比較
如圖 4 所示，對照組海馬 PGC －1α 表達水平為0． 64 ± 0． 19，與對照組相比，運動組海馬 PGC － 1α表達顯著升高\\( 1． 18 ±0． 29，P ＜0． 05\\) ?！緢D4】

2． 5 不同組別大鼠海馬 AMPK 表達的比較
實驗結果顯示\\( 見圖 5\\) ，運動組海馬 AMPK 含量為 2． 1 ±0． 37，與對照組相比\\( 1． 64 ± 0． 29\\) 顯著升高\\( P ＜0． 05\\) 。提示有氧運動訓練可顯著增加海馬 AMPK 表達水平。3 分析與討論海馬是與認知功能高度相關的腦區之一，研究對 8 周有氧運動訓練后大鼠海馬氧化應激水平進行了觀察，發現運動組大鼠海馬 ROS 含量及反應脂質過氧化水平的 MDA 含量顯著降低\\( P ＜ 0． 05，見圖1、圖 3\\) ，而反映腦組織抗氧化水平的 SOD、GPx 活性顯著升高\\( P ＜ 0． 05，見圖 2\\) 。已知體內 ROS 清除的第一道防線是由抗氧化劑的酶促作用組成的，首先在 SOD 的作用下，ROS 轉化為過氧化氫，過氧化氫再在 GPx 和/或過氧化氫酶的作用下被清除，由于腦內過氧化氫酶的含量非常低，因此，腦組織中過氧化氫的清除主要依靠 GPx 來完成。隨著年齡的增長，第一道防線的抗氧化能力逐漸降低，又由于老齡化過程中，海馬對氧化損傷的敏感性增加，因此，老齡化過程中海馬極易受到氧化損傷，只能通過降低神經容量來維持氧化還原的內環境穩態，神經容量的減少影響到學習記憶的能力，繼而導致認知功能的損害。而長期有氧運動訓練后，隨著 SOD、GPx 活性的升高，其抗氧化能力得到增強，氧化應激相關疾病的危險性降低，繼而使老齡化導致的認知功能減退得以緩解，這一途徑可能是運動訓練預防老齡化過程中認知功能減退的重要機制之一。以往研究證實，不同的運動強度對不同組織氧化還原狀態的調節幅度不同。Radak 等研究發現: 一次力竭運動和重復力竭運動會增加肌肉和肝臟中 ROS 的含量和氧化損傷，而適宜強度的規律性運動則會降低大鼠腦內氧化應激水平，這一結果提示，運動訓練過程中訓練的強度和訓練量是關鍵，否則不僅不會起到有益作用，反而會適得其反，加重老齡化過程中認知功能障礙等神經系統退行性疾病的程度?！緢D5】


長期有氧運動訓練可改善大鼠海馬氧化應激水 平，這一現象在以往研究中已經有少量報道。本研究除進一步證實該過程外，還對運動訓練改善其氧化應激水平的深層機制進行了初步探索。PGC －1α 是神經細胞氧化還原平衡的調節因子，是誘導SOD － 1、SOD － 2 和 GPx 等抗氧化酶基因表達的必要因素，PGC －1α 表達的上調可以緩解神經元由于氧化應激介導的細胞死亡，在防止神經變性過程中發揮作用。因此，PGC － 1α 被認為是調解 ROS新陳代謝重要調解因子之一。除此之外，PGC － 1α還可作用于與調控線粒體電子傳遞活動有關的轉錄因子，影響線粒體的功能，進而影響能量代謝。

Koltai 等研究結果顯示，運動訓練可以提高老年大鼠肌肉 PGC －1α 的蛋白表達。Steiner 等研究結果顯示，8 周運動訓練可導致特定腦區 PGC － 1αmRNA 表達的上調。然而，有關長期有氧運動對老年大鼠海馬 PGC －1α 表達影響的研究至今尚未見到相關報道。本研究結果發現，長時間有氧運動可以提高老年大鼠海馬中 PGC －1α 蛋白表達的水平，該途徑可能是導致海馬 SOD、GPx 活性上升，ROS、MDA 含量下降，進而使海馬氧化應激水平得以改善的機制之一。

AMPK 作為調解 PGC － 1α 磷酸化的一種蛋白激酶，其表達變化可對 PGC － 1α 表達產生重要影響。Yu 等研究發現，藥物刺激 AMPK 可以促進視覺皮層神經元 PGC － 1α 的轉錄激活。Jager 等研究結果顯示，骨骼肌 AMPK 的激活可介導 PGC －1α 的表達。因此，探討長期有氧運動對大鼠海馬AMPK 表達的影響對于理解 PGC － 1α 及下游 SOD、GPx 活性變化具有重要意義。本研究結果顯示，長時間有氧運動使大鼠海馬 AMPK 蛋白表達增加。

筆者推測，運動對 AMPK 表達變化的影響可能是通過鈣調節蛋白依賴性激酶\\( Calmodulin － dependentkinase，CaMKK\\) 及氧化還原狀態變化介導的。已知CaMKK 是調節 AMPK 表達變化的上游調節因子之一，Hescham 等研究報道，運動可導致 CaMKK 的變化，繼而可能介導 AMPK 表達的上調。除此之外，運動過程中產生的 ROS 及運動造成的腦組織適度缺氧也會誘導 CaMKK 及 AMPK 表達的增加。

基于以上研究結果，AMPK 激活可能是運動作用于海馬的一個關鍵目標分子，通過調控 AMPK 來調節PGC － 1α，進而來調節 SOD、GPx 活性，起到改善氧化應激水平的目的。

4 結 論

\\( 1\\) 長時間有氧運動可以降低老齡化大鼠海馬的 ROS 水平，減少脂質過氧化損傷，提高抗氧化酶水平。\\( 2\\) 有氧運動可以有效的調節氧化還原平衡狀態，延緩氧化應激引起的神經變性進程。\\( 3\\)AMPK 的激活，PGC － 1α 蛋白表達的增加，可能是改善海馬內氧化還原平衡狀態的分子途徑。