黑質網狀部\\( substantia nigra pars reticulata,SNr\\) 是基底神經節的重要輸出核團之一,在運動行為的維持和運動調控方面發揮重要作用。已有研究發現 SNr 內含有大量的 γ - 氨基丁酸\\( gamma -aminobutyric acid,GABA\\) 能神經元,根據其含有鈣結合蛋白種類的不同分為三種亞型,即小清蛋白\\( Parvalbumin,PV\\) 、鈣結合蛋白 - D28K\\( Calbindin - D28K,CB\\) 以及鈣視網膜蛋白\\( Calretinin,CR\\) 。其中含有 PV 的神經元亞型在 SNr 內大量存在,并且大多屬于 GABA 能投射神經元,分布于 SNr 的信息輸出區域,與基底神經節的信息輸出以及感覺運動功能密切相關。因此本研究采用免疫組織化學染色方法觀察運動疲勞及恢復階段大鼠SNr 內PV 表達水平的變化,以期揭示PV是否參與了運動疲勞過程中重要運動調控腦區神經元的信息調節過程。
1、 材料與方法
1. 1 實驗動物及分組
實驗選擇清潔級健康雄性 SD 大鼠 24 只,體重 200 ±20g,適應性飼養 2 天后將大鼠隨機分為對照組\\( CG\\) 和運動組\\( EG\\) 。其中 EG 又分為即刻組\\( 0EG\\) 、24h 組\\( 24EG\\) 和 48h組\\( 48EG\\) ,每組6 只。
1. 2 疲勞運動模型的建立
本試驗室參照 Bedford方法修改建立了三級遞增負荷跑臺運動方案。動物先進行3 天適應性跑臺訓練,從第4 天開始正式跑臺運動,負荷分為三級,每級跑速分別為 8. 2m/min、15m / min、20m / min,第Ⅰ、Ⅱ級分別運動 15min,第Ⅲ級運動直至力竭,運動周期為7 天。對照組動物相同條件下常規飼養,不進行跑臺運動。
1. 3 PV 免疫組化染色
大鼠經水合氯醛麻醉后,開胸經左心室灌流生理鹽水200ml 沖洗血液,再用冰冷的 4% 多聚甲醛灌注 5 - 10min。灌流完畢后立即取腦,置于 4% 多聚甲醛中后固定 4h,隨后將腦轉移到30%蔗糖溶液中直至沉底。切制 50um 厚的冠狀冰凍切片,收集于0.1mol/L 磷酸緩沖液內,按下述步驟進行 PV 免疫組織化學染色: 切片置于3%H2O2 中室溫封閉 20min; 3%馬血清室溫封閉30min; 一抗室溫孵育2h; 二抗室溫孵育 2h; ABC復合物結合反應2h; DAB 顯色劑顯色20min。然后將切片貼于涂有明膠的載玻片上,脫水透明,加拿大中性樹脂封片。
1. 4 圖像分析與數據處理
采集 SNr 核團的 PV 免疫染色圖像,分別從四組大鼠 SNr核團相同層面的連續腦片中選取6 張腦片進行統計,用圖像分析軟件 Image Pro Plus\\( Media Cybernetics 公司\\) 分別計算其陽性細胞面密度值和陽性纖維染色的消減平均灰度值\\( 背景物平均灰度與陽性物平均灰度之差\\) 作為統計對象,所得結果均用平均數 ±標準誤\\( Mean ± SEM\\) 表示。應用 SPSS16. 0 統計軟件進行分析,P <0.05 表示組間有顯著性差異; P <0. 01 表示組間有極其顯著性差異。
2、 結果
DAB 染色結果顯示,PV 陽性標記集中分布于 SNr 外側部約2/3 區域。經過統計分析,CG、24EG 和 48EG 三組大鼠 PV陽性細胞平均面密度均顯著性高于 0EG 組\\( P < 0. 05,P < 0.01\\) \\( 見圖 1\\) 。陽性纖維消減灰度值組間比較結果表明,0EG大鼠纖維表達水平較 CG 大鼠顯著下降\\( P < 0. 01\\) ,恢復至24h,纖維表達水平沒有顯著的回升,仍顯著低于 CG 大鼠\\( P <0. 01\\) 。當恢復到 48h 時,PV 陽性纖維表達水平與 0EG、24EG相比有顯著增強\\( P <0.01; P <0. 01\\) ,基本恢復到運動前對照組水平\\( P >0.05\\) 。
3、討論
Rodríguez 和 González - Hernández 研究發現,從黑質投射到丘腦和紋狀體的 GABA 能投射神經元,大部分都具有高頻放電的特性,并且存在 PV 陽性表達。SNr 是基底神經節主要的輸出核團之一,是紋狀體信息傳入的主要靶核團,SNr 外側區主要接受來自于紋狀體腹外側區即紋狀體接受感覺運動皮層信息輸入區域的神經投射。West 等人研究發現,紋狀體中與肢體運動相關的神經元位于其腹外側區。本實驗結果顯示,CG 大鼠 SNr 內 PV 陽性細胞和纖維遍布于 SNr 外側約2/3 區域,與以往的研究報道一致。運動疲勞后,SNr 內PV 表達水平在短期內顯著下降,恢復 24h 后明顯回升,并隨著恢復時間的延長逐漸達到對照組水平,揭示 SNr 內 PV 參與了運動疲勞產生的神經生物學調控。
雖然目前 SNr 內 PV 的確切功能還尚不清楚,但在神經系統內有關 PV 的研究表明,其主要參與調節和緩沖胞內鈣離子濃度,并且在實現鈣離子與其它第二信使之間的相互聯系中發揮重要作用。由此推測,運動疲勞后SNr 神經元鈣離子濃度的變化也可能與 PV 陽性表達短時間內缺失有關。此外,PV在神經系統內的生物學作用非常廣泛,如神經遞質的釋放、酶的活性、神經電活動等。綜上所述,PV 參與了多種神經生物學調控和功能的維持,其表達的缺失可以導致神經系統疾病和運動行為的異常; 運動疲勞導致 SNr 內 PV 陽性神經元和纖維的表達在短時間內顯著性的下降,可能也會影響該腦區 GABA能神經元的放電活動,繼而影響基底神經節對皮層運動區的神經信號調控。
