脆性X綜合征(fragileXsyndrome,FXS)是常見的X連鎖先天性智力低下疾病,FMR1(fragileXmentalretardation1,FMR1)基因的突變或缺失可導致FXS。FMR1基因敲除小鼠(KO鼠)與FXS患者有很多相似的癥狀,包括不同程度的智力低下、巨睪癥等,是研究FXS成熟的動物模型。
神經肽Y(neuropeptideY,NPY)是一種含36個氨基酸的單鏈肽,與下丘腦神經內分泌功能密切相關,在生殖功能起重要調節作用。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)是中樞神經系統中一種重要的抑制性神經遞質,對下丘腦-垂體-卵巢軸有深刻的影響,參與生殖活動的調節。
研究發現FXS女性20%會出現卵巢早衰,而在KO鼠的繁殖過程中亦發現其繁殖能力有改變。
因此,我們旨在研究FMR1基因敲除雌鼠生殖功能的變化,并對其可能的機制進行探究。
1、材料與方法
1.1材料
FMR1基因敲除小鼠(FVBKO)是以正常野生型FVB(FVBWT)小鼠為背景,利用基因敲除技術將FMR1基因定點滅活制備成人類脆性X綜合征的代表性實驗動物模型。該基因敲除模型鼠于2002年由廣州醫學院神經科學研究所從荷蘭Erasmus大學實驗動物科學中心引進,經廣州醫學院實驗動物中心繁育飼養建立了該品系的清潔級種群。所有實驗動物的操作及飼養均符合國家標準,遵循人道原則。實驗小鼠均飼養在清潔級環境中,自由進水和飲食,室內溫度為20~26℃,相對濕度為50%~70%,光照明暗交替12h∶12h。出生后5~7周為小鼠性成熟期,8~12周為小鼠繁殖適齡期,本研究選擇10周雌性小鼠為研究對象。
1.2主要試劑與設備
PCR試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司),兔抗鼠NPY多克隆抗體(Abcam),豚鼠抗鼠GABA多克隆抗體(Abcam)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗及羊抗豚鼠IgG二抗(福州邁新生物技術開發有限公司),小鼠血清NPYELISA試劑盒(廣州市魯誠生物科技有限公司),光學顯微鏡(日本Olympus-BH22),酶標儀(芬蘭Thermo)。
1.3實驗動物基因型鑒定
按文獻的方法。
1.4繁殖力試驗
選取成年的KO純合子、KO雜合子及WT雌鼠分別與成年的WT雄鼠合籠,合籠比例為雌鼠:雄鼠=2∶1,每天早上八點和下午兩點觀察雌鼠是否有孕栓形成,記錄合籠時間和產仔數。
1.5卵巢形態學觀察
HE染色觀察卵巢形態及卵泡計數,卵泡計數方法參照文獻。
1.6免疫組化法測定下丘腦NPY、GABA的表達
免疫組織化學染色方法按試劑盒操作說明書進行,DAB顯色,以PBS代替一抗作為陰性對照,相同條件下已知陽性片作陽性對照,高倍光鏡下觀察切片(×400),用ImageProPlus6.0圖像分析軟件分析其平均光密度值。平均光密度值越大,陽性表達越強。
1.7ELISA法測定血清NPY水平
按ELISA試劑盒說明書步驟進行。
1.8統計學處理
所有的數據采用SPSS16.0軟件進行分析,正態分布的計量資料以(x±s)表示,組間均數采用單因素方差分析。P<0.05為差異有顯著性。
2、結果
2.1實驗動物基因型鑒定結果
KO鼠和WT鼠分別擴增出約800bp和468bp的DNA片段,見圖1。
2.2繁殖力試驗結果
3組小鼠合籠天數及產仔數比較,KO純合子雌鼠產仔數少于WT雌鼠(P<0.05),見表1。
2.3卵巢組織形態比較
KO純合子、KO雜合子、WT雌鼠卵巢形態未見明顯不同,見圖2;KO純合子雌鼠卵泡總數少于WT雌鼠(P<0.05),見表2。
2.4下丘腦NPY的表達及其平均光密度值比較
NPY在下丘腦的表達結果,見圖3;KO純合子雌鼠下丘腦NPY的表達弱于WT雌鼠,差異有顯著性(P<0.05),見表3。
2.5下丘腦GABA的表達及其平均光密度比較
GABA在下丘腦的表達結果,見圖3;三種基因型小鼠下丘腦GABA的表達差異無顯著性(P>0.05),見表3。2.6血清NPY表達的比較3組小鼠血清NPY的表達量差異無顯著性(P>0.05),見表4。
3、討論
FXS是X連鎖不完全顯性遺傳病,發病率男性為1/1250,女性為1/2500,在X連鎖智力低下中占40%,99%的FXS是由于脆性X智力低下基因1(FMR1)的動態突變引起,1%是由于FMR1基因的錯義突變或缺失突變引起。FMR1基因位于X染色體的長臂遠端Xq27.3區的脆性部位,含17個外顯子,在該基因的5‘非翻譯區存在一段數目可變的(CGG)n重復序列,其上游250bp處存在一CpG島。(CGG)n結構的重復擴增會造成CpG島的異常甲基化,從而關閉FMR1基因的轉錄,導致其編碼的脆性x智力低下蛋白(FMRP)的表達減少或缺失,進而引起一系列的臨床表現,主要表現為智力低下、自閉癥、認知障礙、女性成年期卵巢早衰及男性青春期后大睪丸。FMR1基因敲除小鼠是在FMR1基因的第5個外顯子中插入了一個新霉素表達片斷,從而阻斷了500bpDNA片斷的擴增,導致FM-RP表達的缺失而制備成FXS的動物模型,其活動過度,學習記憶力減退,易激惹,青春期后睪丸增大,是研究FXS成熟的動物模型。
近年來已有文獻報告FMR1基因的缺失對小鼠的生殖功能有影響,祝亞橋等研究發現KO雄鼠的生育能力和WT小鼠相比是降低的,但兩者的精子生成量、精子存活率、精子畸形率及血清性激素水平無差別,考慮為KO雄鼠的腦部病變,或與勃起相關的因素改變而引起。在對雌性FMR1基因敲除小鼠生殖功能的研究中戴麗軍等應用10u孕馬血清促性腺激素(PMSG)和10u人絨毛膜促性腺激素(HCG)對10周的FVB.KO和FVB.WT雌鼠超排卵處理后,血清性激素水平和超排卵數差異均無顯著性(P>0.05),提示超排不影響FMR1基因敲除小鼠的繁殖性能。同時該研究發現FVB.KO的產仔數較FVB.WT是降低。以上的研究均提示FMR1基因的缺失降低了小鼠的生育率,但對其影響機制未作進一步的研究,本實驗除了應用產仔數這一傳統指標對FMR1基因敲除小鼠的繁殖性能進行評估外,更運用了卵泡計數這一更直觀的證據加以說明,在他們研究的基礎上本實驗著重探討FMR1基因是通過何種機制來影響小鼠的生殖功能的。
本研究顯示成年的KO純合子、KO雜合子、WT雌鼠與成年的WT雄鼠合籠,KO純合子雌鼠的產仔數少于WT雌鼠,P<0.05,這與前人的研究結果相同。HE染色觀察3種基因型雌鼠的卵巢形態發現:
卵巢皮質、髓質層次分明,原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡及黃體均可見,原始卵泡、次級卵泡較多,另可見少量閉鎖卵泡及間質腺,3組間其卵巢形態未見明顯不同。3組間卵泡總數比較發現:KO純合子雌鼠的卵泡總數少于WT雌鼠,P<0.05。卵泡數目是反映卵巢儲備的重要的指標,卵泡數目的減少標志著生殖功能的下降。這一結果同樣支持KO純合子雌鼠的生育功能是下降的,而實驗未發現KO雜合子雌鼠的生殖功能有下降,這說明FMR1基因的完全缺失可能才會影響其生殖功能,其具體機制有待于進一步研究。
KO純合子雌鼠的生育功能是下降的,那么FMR1基因是通過何種途徑來調節其生殖功能的呢?NPY是一種含36個氨基酸的單鏈肽,與下丘腦神經內分泌功能等生理過程的調節密切相關,NPY可影響下丘腦-垂體-卵巢軸的活動,對排卵前LH峰的形成有促進作用,NPY表達的下降可引起LH峰形成不良,從而影響排卵。NPY還可影響Ca2+的濃度而調節卵巢的血流,從而影響卵泡的發育。本研究發現在KO鼠的中樞神經系統中,下丘腦室周核、正中隆起、下丘腦外側區、弓狀核、背側區及腹內側核均可見NPY陽性細胞的表達,正中隆起、下丘腦弓狀核及背側區這些與生殖調節密切相關的區域,其NPY表達更強烈,3種基因型雌鼠其NPY表達部位無明顯不同,經統計,KO純合子雌鼠下丘腦NPY的表達弱于WT雌鼠,這提示FMR1基因可能是通過下調NPY的表達來調節雌鼠生殖功能的。
GABA是中樞神經系統重要的抑制性神經遞質,通過下丘腦-垂體-性腺軸影響垂體和性腺的生理機能,也可以通過多巴胺系統抑制LH和PRL的分泌,對生殖功能有重要的調節作用。本研究發現GABA陽性細胞在下丘腦弓狀核、室周核、腹內側核背部和腹部以及下丘腦背側區均有表達。在下丘腦弓狀核和室周核GABA表達更強烈,3種基因型雌鼠其GABA表達部位未見明顯不同。經統計,3種基因型雌鼠其下丘腦GABA的表達量差異亦無顯著性,提示FMR1基因可能不是直接調節GABA來影響其生殖功能的,而可能是通過GABA受體信號通路。
NPY和GABA在下丘腦均有表達,且在弓狀核兩者表達均更強烈,NPY和GABA均可調節生殖功能,但NPY和GABA是否可以相互調節從而影響生殖功能,還有待于進一步的研究。本實驗初步探討了FMR1基因的缺失對雌鼠生育功能的影響,下一步將研究FMR1基因是如何調控NPY的表達及GA-BA受體信號通路在KO鼠中的作用。
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