脆性X綜合征（fragileXsyndrome，FXS）是常見的X連鎖先天性智力低下疾病，FMR1（fragileXmentalretardation1，FMR1）基因的突變或缺失可導致FXS。FMR1基因敲除小鼠（KO鼠）與FXS患者有很多相似的癥狀，包括不同程度的智力低下、巨睪癥等，是研究FXS成熟的動物模型。
神經肽Y（neuropeptideY，NPY）是一種含36個氨基酸的單鏈肽，與下丘腦神經內分泌功能密切相關，在生殖功能起重要調節作用。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）是中樞神經系統中一種重要的抑制性神經遞質，對下丘腦-垂體-卵巢軸有深刻的影響，參與生殖活動的調節。
研究發現FXS女性20%會出現卵巢早衰，而在KO鼠的繁殖過程中亦發現其繁殖能力有改變。
因此，我們旨在研究FMR1基因敲除雌鼠生殖功能的變化，并對其可能的機制進行探究。
1、材料與方法
1.1材料
FMR1基因敲除小鼠（FVBKO）是以正常野生型FVB（FVBWT）小鼠為背景，利用基因敲除技術將FMR1基因定點滅活制備成人類脆性X綜合征的代表性實驗動物模型。該基因敲除模型鼠于2002年由廣州醫學院神經科學研究所從荷蘭Erasmus大學實驗動物科學中心引進，經廣州醫學院實驗動物中心繁育飼養建立了該品系的清潔級種群。所有實驗動物的操作及飼養均符合國家標準，遵循人道原則。實驗小鼠均飼養在清潔級環境中，自由進水和飲食，室內溫度為20~26℃，相對濕度為50%~70%，光照明暗交替12h∶12h。出生后5~7周為小鼠性成熟期，8~12周為小鼠繁殖適齡期，本研究選擇10周雌性小鼠為研究對象。
1.2主要試劑與設備
PCR試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司），兔抗鼠NPY多克隆抗體（Abcam），豚鼠抗鼠GABA多克隆抗體（Abcam）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG二抗及羊抗豚鼠IgG二抗（福州邁新生物技術開發有限公司），小鼠血清NPYELISA試劑盒（廣州市魯誠生物科技有限公司），光學顯微鏡（日本Olympus-BH22），酶標儀（芬蘭Thermo）。
1.3實驗動物基因型鑒定
按文獻的方法。
1.4繁殖力試驗
選取成年的KO純合子、KO雜合子及WT雌鼠分別與成年的WT雄鼠合籠，合籠比例為雌鼠：雄鼠=2∶1，每天早上八點和下午兩點觀察雌鼠是否有孕栓形成，記錄合籠時間和產仔數。
1.5卵巢形態學觀察
HE染色觀察卵巢形態及卵泡計數，卵泡計數方法參照文獻。
1.6免疫組化法測定下丘腦NPY、GABA的表達
免疫組織化學染色方法按試劑盒操作說明書進行，DAB顯色，以PBS代替一抗作為陰性對照，相同條件下已知陽性片作陽性對照，高倍光鏡下觀察切片（×400），用ImageProPlus6.0圖像分析軟件分析其平均光密度值。平均光密度值越大，陽性表達越強。
1.7ELISA法測定血清NPY水平
按ELISA試劑盒說明書步驟進行。
1.8統計學處理
所有的數據采用SPSS16.0軟件進行分析，正態分布的計量資料以（x±s）表示，組間均數采用單因素方差分析。P<0.05為差異有顯著性。
2、結果
2.1實驗動物基因型鑒定結果
KO鼠和WT鼠分別擴增出約800bp和468bp的DNA片段，見圖1。
2.2繁殖力試驗結果
3組小鼠合籠天數及產仔數比較，KO純合子雌鼠產仔數少于WT雌鼠（P<0.05），見表1。
2.3卵巢組織形態比較
KO純合子、KO雜合子、WT雌鼠卵巢形態未見明顯不同，見圖2；KO純合子雌鼠卵泡總數少于WT雌鼠（P<0.05），見表2。
2.4下丘腦NPY的表達及其平均光密度值比較
NPY在下丘腦的表達結果，見圖3；KO純合子雌鼠下丘腦NPY的表達弱于WT雌鼠，差異有顯著性（P<0.05），見表3。
2.5下丘腦GABA的表達及其平均光密度比較
GABA在下丘腦的表達結果，見圖3；三種基因型小鼠下丘腦GABA的表達差異無顯著性（P>0.05），見表3。2.6血清NPY表達的比較3組小鼠血清NPY的表達量差異無顯著性（P>0.05），見表4。
3、討論
FXS是X連鎖不完全顯性遺傳病，發病率男性為1/1250，女性為1/2500，在X連鎖智力低下中占40%，99%的FXS是由于脆性X智力低下基因1（FMR1）的動態突變引起，1%是由于FMR1基因的錯義突變或缺失突變引起。FMR1基因位于X染色體的長臂遠端Xq27.3區的脆性部位，含17個外顯子，在該基因的5‘非翻譯區存在一段數目可變的（CGG）n重復序列，其上游250bp處存在一CpG島。（CGG）n結構的重復擴增會造成CpG島的異常甲基化，從而關閉FMR1基因的轉錄，導致其編碼的脆性x智力低下蛋白（FMRP）的表達減少或缺失，進而引起一系列的臨床表現，主要表現為智力低下、自閉癥、認知障礙、女性成年期卵巢早衰及男性青春期后大睪丸。FMR1基因敲除小鼠是在FMR1基因的第5個外顯子中插入了一個新霉素表達片斷，從而阻斷了500bpDNA片斷的擴增，導致FM-RP表達的缺失而制備成FXS的動物模型，其活動過度，學習記憶力減退，易激惹，青春期后睪丸增大，是研究FXS成熟的動物模型。
近年來已有文獻報告FMR1基因的缺失對小鼠的生殖功能有影響，祝亞橋等研究發現KO雄鼠的生育能力和WT小鼠相比是降低的，但兩者的精子生成量、精子存活率、精子畸形率及血清性激素水平無差別，考慮為KO雄鼠的腦部病變，或與勃起相關的因素改變而引起。在對雌性FMR1基因敲除小鼠生殖功能的研究中戴麗軍等應用10u孕馬血清促性腺激素（PMSG）和10u人絨毛膜促性腺激素（HCG）對10周的FVB.KO和FVB.WT雌鼠超排卵處理后，血清性激素水平和超排卵數差異均無顯著性（P>0.05），提示超排不影響FMR1基因敲除小鼠的繁殖性能。同時該研究發現FVB.KO的產仔數較FVB.WT是降低。以上的研究均提示FMR1基因的缺失降低了小鼠的生育率，但對其影響機制未作進一步的研究，本實驗除了應用產仔數這一傳統指標對FMR1基因敲除小鼠的繁殖性能進行評估外，更運用了卵泡計數這一更直觀的證據加以說明，在他們研究的基礎上本實驗著重探討FMR1基因是通過何種機制來影響小鼠的生殖功能的。
本研究顯示成年的KO純合子、KO雜合子、WT雌鼠與成年的WT雄鼠合籠，KO純合子雌鼠的產仔數少于WT雌鼠，P<0.05，這與前人的研究結果相同。HE染色觀察3種基因型雌鼠的卵巢形態發現：
卵巢皮質、髓質層次分明，原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡及黃體均可見，原始卵泡、次級卵泡較多，另可見少量閉鎖卵泡及間質腺，3組間其卵巢形態未見明顯不同。3組間卵泡總數比較發現：KO純合子雌鼠的卵泡總數少于WT雌鼠，P<0.05。卵泡數目是反映卵巢儲備的重要的指標，卵泡數目的減少標志著生殖功能的下降。這一結果同樣支持KO純合子雌鼠的生育功能是下降的，而實驗未發現KO雜合子雌鼠的生殖功能有下降，這說明FMR1基因的完全缺失可能才會影響其生殖功能，其具體機制有待于進一步研究。
KO純合子雌鼠的生育功能是下降的，那么FMR1基因是通過何種途徑來調節其生殖功能的呢？NPY是一種含36個氨基酸的單鏈肽，與下丘腦神經內分泌功能等生理過程的調節密切相關，NPY可影響下丘腦-垂體-卵巢軸的活動，對排卵前LH峰的形成有促進作用，NPY表達的下降可引起LH峰形成不良，從而影響排卵。NPY還可影響Ca2+的濃度而調節卵巢的血流，從而影響卵泡的發育。本研究發現在KO鼠的中樞神經系統中，下丘腦室周核、正中隆起、下丘腦外側區、弓狀核、背側區及腹內側核均可見NPY陽性細胞的表達，正中隆起、下丘腦弓狀核及背側區這些與生殖調節密切相關的區域，其NPY表達更強烈，3種基因型雌鼠其NPY表達部位無明顯不同，經統計，KO純合子雌鼠下丘腦NPY的表達弱于WT雌鼠，這提示FMR1基因可能是通過下調NPY的表達來調節雌鼠生殖功能的。
GABA是中樞神經系統重要的抑制性神經遞質，通過下丘腦-垂體-性腺軸影響垂體和性腺的生理機能，也可以通過多巴胺系統抑制LH和PRL的分泌，對生殖功能有重要的調節作用。本研究發現GABA陽性細胞在下丘腦弓狀核、室周核、腹內側核背部和腹部以及下丘腦背側區均有表達。在下丘腦弓狀核和室周核GABA表達更強烈，3種基因型雌鼠其GABA表達部位未見明顯不同。經統計，3種基因型雌鼠其下丘腦GABA的表達量差異亦無顯著性，提示FMR1基因可能不是直接調節GABA來影響其生殖功能的，而可能是通過GABA受體信號通路。
NPY和GABA在下丘腦均有表達，且在弓狀核兩者表達均更強烈，NPY和GABA均可調節生殖功能，但NPY和GABA是否可以相互調節從而影響生殖功能，還有待于進一步的研究。本實驗初步探討了FMR1基因的缺失對雌鼠生育功能的影響，下一步將研究FMR1基因是如何調控NPY的表達及GA-BA受體信號通路在KO鼠中的作用。
參 考 文 獻：
[1] GANTOIS I, BAKKER CE, REYNIERS E, et al. Restoring thephenotype of fragile X syndrome: insight from the mouse model[J]. Curr Mol Med, 2001, 1\\(4\\): 447-455.
[2] BAKKER CE, VERHEIJ C, REYNIERS E, et al. Fmrl knockoutmice: a model to study fragile X mental retardation[J]. Cell, 1994,78\\(1\\): 23-33.
[3] XU J, KIRIGITI MA, COWLEY MA, et al. Suppression of basalspontaneous gonadotropin-releasing hormone neuronal activityduring lactation: role of inhibitory effects of neuropeptide Y[J].
Endocrinology, 2009, 150\\(1\\): 333-340.
[4] HRABOVSZKY E, MOLNAR CS, NAGY R, et al. Glutamatergicand GABAergic innervation of human gonadotropin-releasing hor-mone-I neurons[J]. Endocrinology, 2012, 153\\(6\\): 2766-2776.
[5] MACHADO-FERREIRA MC, COSTA-LIMA MA, BOY RT, eta1. Premature ovarian failure and FRAXA permutation :Positivecorrelation in a Brazilian survey [J]. Am J Med Genet, 2004,126A\\(3\\): 237-240.
[6] 邢 州,孫衛文,黃月玲,等.使用 PCR 方法檢測 Fmr1 基因敲除小鼠基因型[J].現代醫院,2009,9\\(5\\):12.
[6] XING Z, SUN WW, HUANG YL, et al . Detection of genotypeof Fmr1 gene Knocked out mice by using PCR[J]. J ModernHosp, 2009, 9\\(5\\): 12. Chinese[7] MYERS M, BRITT KL, WREFORD NG, et al. Methods forquantifying follicular numbers within the mouse ovary[J]. Repro-duction, 2004, 127\\(5\\): 569-580.
[8] ACOG Committee Opinion. No. 338: Screening for fragile X syn-drome[J]. Obstet Gynecol, 2006, 107\\(6\\): 1483-1485.
[9] COFFEE RL JR, TESSIER CR, WOODRUFF EA, et al. FragileX mental retardation protein has a unique, evolutionarily con-served neuronal function not shared with FXR1P or FXR2P[J].Dis Model Mech, 2010, 3\\(7-8\\): 471-485.
[10] 祝亞橋,周 興,陳盛強.FMR1 基因敲除對雄性小鼠生殖功能的影響[J].實用醫學雜志,2012,28\\(4\\):564-567.
[10] ZHU YQ, ZHOU X, CHEN SQ. The influence of FMR1 geneknockout on the reproduction of male mice[J]. Journal of Prac-tical Medicine, 2012, 28\\(4\\): 564-567. Chinese[11] 戴麗軍,廖 軍,黃月玲,等.Fmr1 基因敲除小鼠血清雌性激素含量的比較研究[J].中國比較醫學雜志,2006,16\\(8\\):459-462.
[11] DAI LJ, LIAO J, HUANG YL, et al . FSH, LH, E2 and P inblood serum of Fmr1 knockout mouse and FVB mouse[J]. Chi-nese Journal of Comparative Medicine, 2006, 16\\(8\\): 459-462.
Chinese[12] CHAMBERS AP, WOODS SC. The role of neuropeptide Y inenergy homeostasis[J]. Handb Exp Pharmacol, 2012\\(209\\): 23-45.
[13] KLENKE U, CONSTANTIN S, WRAY S, et al. Neuropeptide Ydirectly inhibits neuronal activity in a subpopulation of go-nadotropin-releasing hormone-1 neurons via Y1 receptors [J].Endocrinology, 2010, 151\\(6\\): 2736-2746.
[14] KEATOR CS, CUSTER EE, HOAGLAND TA, et al. Evidencefor a potential role of neuropeptide Y in ovine corpus luteumfunction[J]. Domest Anim Endocrinol, 2010, 38\\(2\\): 103-114.
[15] ROA J, HERBISON AE. Direct regulation of GnRH neuron ex-citability by arcuate nucleus POMC and NPY neuron neuropep-tides in female mice[J]. Endocrinology, 2012, 153\\(11\\): 5587-5599.
[16] NAKAYAMA Y, HATTORI N, OTANI H, et al. Gam-ma-aminobutyric acid \\(GABA\\)-C receptor stimulation increasesprolactin\\(PRL\\) secretion in cultured rat anterior pituitary cells[J].Biochem Pharmacol, 2006, 71\\(12\\): 1705-1710.
[17] HEMOND PJ, O'BOYLE MP, ROBERTS CB, et al. SimulatedGABA synaptic input and L-type calcium channels form func-tional microdomains in hypothalamic gonadotropin-releasing hor-mone neurons[J]. J Neurosci, 2012, 32\\(26\\): 8756-8766.
