糖尿病是全球性健康問題,發病率近幾十年呈不斷上升趨勢,80%以上2型糖尿病\\(T2DM\\)患者伴隨肥胖。T2DM的主要病理特征是胰島素及瘦素抵抗,由此導致糖、脂肪、蛋白及電解質代謝紊亂,常并發肥胖、高血壓、血脂異常及動脈粥樣硬化等,稱為“代謝綜合征”,影響患者的生活質量及壽期。

亞洲國家應用傳統中醫藥治療糖尿病已有幾千年歷史,五加科人參屬植物三七作為一種重要藥材已在 中 國 應 用 近600年,三 七 總 皂 苷 \\(Panaxnotoginseng saponins,PNS\\)是三七中的主要活性成分,我們研究發現三七根部提取的PNS對T2DMKK-Ay鼠具有抗高血糖、抗肥胖作用。

我們前期研究分析PNS成分發現,其主要含人參皂苷Rb1\\(Rb1\\)、人參皂苷Rg1\\(Rg1\\)、人參皂苷Rd\\(Rd\\)、人參皂苷Re\\(Re\\)及三七皂苷R1\\(R1\\)五種皂苷。其中Rg1、R1、Re屬原人參萜三醇皂苷,Rb1和Rd為人參萜二醇皂苷。已有文獻報道Rb1和Rg1均能促進葡萄糖刺激的胰島素分泌并減少甘油三酯的蓄積,Rb1能在體外活化過氧化物酶增殖物激活受體γ\\(PPARγ\\),亦有文獻報道Re對肥胖T2DM小鼠有降糖、降胰島素作用。

本實驗將通過研究PNS對KK-Ay鼠胰島素和瘦素調節作用的影響,探討PNS抗高血糖和抗肥胖的機理,并探討PNS中發揮降血糖作用的主要有效成分,旨在為抗糖尿病新藥研發及PNS的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

10周齡SPF級雄性KK-Ay鼠,體質量為28~31g,合格證號:SCXK\\(京\\)2005-0013,標準全價營養飼料,均由中國醫學科學院實驗動物研究所提供;10周齡SPF級雄性C57BL/6J鼠,體質量為20~23g,合格證號:川實動管質第09號,由四川大學華西醫學實驗動物中心提供,標準鈷60照射飼料,成都達碩生物科技有限公司。動物單籠飼養,12h晝夜交替光照,室溫20~24 ℃,濕度50%~60%,自由攝食、飲水,實驗前適應性飼養1周。

1.2 藥品試劑與儀器

三七藥材購于云南文山,由中國藥品生物制品檢定研究所鑒定;PNS\\(批號:110870-200201\\)、Rb1\\(0.984%,批號:110704-200318\\)、Rg1\\(0.989%,批號:110703-200322\\)、Rd\\(0.981%,批號:050402\\)、Re\\(0.985%,批號:0754-9911\\)及R1\\(0.985%,批號:110745-200313\\)對照品,均由中國藥品生物制品檢定所提供;胰島素放免分析試劑盒\\(北京北方生物技術研究所\\);瘦素ELISA試劑盒\\(上海江萊生物科技有限公司\\);TC、TG診斷試劑、羅康全活力型血糖試紙\\(均為美國Roche診斷試劑廠\\)。

LC-10A型高效液相色譜儀,日本島津公司;UV-2102C型紫外可見分光光度計,上海尤尼柯儀器有限公司;羅康全活力型血糖儀,德國羅氏公司;SN6-95B型智能放免γ測量儀,上海原子核研究所;FAME24/20型全自動微孔板ELISA分析儀,瑞士HAMILTON公司;Olympus AU5400型生化分析儀,日本Olympus公司;MDF-382E型超低溫冰箱,日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 PNS分析PNS的成分分析參考文獻進行。前期研究的比色法測定,三七根部提取物的總皂苷含量高于99%。高效液相色譜法測定各種皂苷含量,即人參皂苷Rb1、Rg1、Rd、Re及三七皂苷R1,含量分別為29.9%、20.5%、7.96%、6.83%及2.74%,其中三七皂苷R1是PNS中的特有成分,人參總皂苷中不含該成分。

1.3.2 PNS,R1及Rb1、Rg1、Rd、Re的配制實驗前分別將PNS、Rb1、Rg1、Rd、Re、R1溶于生理鹽水注射液,PNS、Rb1、Re于常溫下溶解,R1、Rd、Rg1于70℃水浴加熱溶解。根據PNS中各皂苷的百分 含 量,200 mg/kg體 質 量 的PNS相 當 于60mg/kg體質量Rb1、40mg/kg體質量Rg1、15mg/kg體質量Rd、14mg/kg體質量Re和6mg/kg體質量R1組成,配制的20mg/L PNS生理鹽水為微黃色澄明溶液,6mg/L Rb1、4mg/L Rg1、1.5mg/L Rd、1.4mg/L Re、0.6mg/L R1生理鹽水均為無色溶液,上述溶液均用于腹腔注射給藥。

1.3.3 動物分組與給藥實驗前動物禁食6h,不禁水。將健康C57BL/6J鼠設為正常對照組,KK-Ay鼠選空腹血糖\\(FBG\\)≥13.89mmol/L者隨機均分為模型組、PNS組及Rb1、Rg1、Rd、Re、R1組,每組6只。正常對照組和模型組均注射生理鹽水10mL/kg體質量。各實驗組按其分組選擇對應劑量注射,均為10mL/kg體質量。正常、模型和PNS組連續給藥30d,Rb1、Rg1、Rd、Re、R1組連續給藥12d,均于每天早8∶00腹腔注射給藥1次。

1.3.4 指標測定所有組于給藥第0、12d\\(Rb1、Rg1、Rd、Re、R1治療結束時\\)及30d\\(PNS治療結束時\\)8∶30動物禁食,14∶30稱體質量、尾尖采血,葡萄糖氧化酶法測各組鼠FBG。以藥后體質量值-藥前體質量值\\)/藥前體質量值×100%計算體質量增長率。除禁食外,每天給藥前稱量食物,計算日均攝食量。

正常組、模型組、PNS組給藥第0、30d測FBG后,立即腹腔注射葡萄糖1g/kg體質量,并于0、30、60、120min測血糖,計算0~120min的血糖曲線下面積\\(AUC\\)以評估糖耐量情況。給藥30d,正常組、模型組、PNS組禁食8h后,乙醚麻醉摘眼球取血,3 000r/min離心10min,取血清,測生化指標。放射免疫分析法法測血清胰島素,酶聯免疫分析法法測瘦素,酶法測甘油三酯和膽固醇。取血后,小鼠立即股動脈放血處死,取附睪脂肪墊稱重。胰島素抵抗指數\\(IRI\\)用HOMA-IR法計算:IRI=空腹血糖濃度×血漿胰島素濃度/22.5。

1.3.5 統計學方法實驗數據均以珚x±s表示,方差齊則多組間比較采用單因素單方差分析,進一步兩兩比較采用LSD法;方差不齊則采用Dunnett’sT3法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KK-Ay鼠12d時體質量和攝食量變化由表1可知,模型組和各實驗組在0d、12d體質量及0~12d平均日攝食量均高于正常對照組\\(P<0.01\\),但體質量增長率的差異無統計學意義\\(P>0.05\\)。Rb1、Rg1、Rd、Re、R1組與模型組相比,上述指標差異均無統計學意義\\(P>0.05\\)。

2.2 KK-Ay鼠30d的FBG變化結果見圖1。各組KK-Ay鼠的FBG均明顯高于C57鼠正常對照組\\(P<0.05\\)。給藥前\\(0d\\),PNS、Rg1、Rd、Re、R1及模型組與正常組相比,P均<0.01;給藥12d,PNS、Rb1組與模型組相比FBG下降\\(P<0.05\\),Re、Rg1、Rd、R1組與模型組相比差異無統計學意義\\(P均>0.05\\)。給藥30d,PNS組的FBG與模型組相比進一步下降\\(P<0.01\\)?！颈?】


2.3 KK-Ay鼠30d時糖耐量變化由圖2A可知,給藥前\\(0d\\)PNS組及模型組與正常對照組比,存在高血糖癥,且在腹腔注射葡萄糖后PNS組和模型組的血糖進一步升高,120min后未降回基礎水平,表明PNS組和模型組的糖耐量升高。由圖2B可知,給藥30d,與模型組相比,PNS組的血糖AUC下降了40%\\(給藥前為24.06min·mmol/L,給藥30d降至14.42min·mmol/L\\),表明PNS能改善KK-Ay鼠的糖耐量\\(P<0.01\\)。

2.4 KK-Ay鼠30d時胰島素、瘦素抵抗,體質量、攝食量、脂肪組織及血脂的變化由表2可知,與模型組比,PNS給藥30d后,血清胰島素、IRI、瘦素、體質量增長率、攝食量、附睪脂肪墊質量、甘油三酯均下降\\(P<0.05或P<0.01\\).

PNS組和模型組的血清膽固醇水平差異無統計學意義。12~30d體質量變化率低于正常對照組?！緢D1】


3 討論

KK-Ay鼠是一種嚙齒類的遺傳型瘦素耐受模型,由于異位表達剌鼠蛋白,會發生遲發性的肥胖癥和T2DM。10周齡以上的KK-Ay鼠常出現胰島素抵抗,即胰島素不敏感,導致胰島素介導的糖耐量明顯下降。這類鼠具有肥胖及代謝紊亂的典型特征,如高血糖、糖耐量降低、胰島素抵抗、高甘油三酯血癥、高血壓、瘦素抵抗,這與人類T2DM相似。因此,KK-Ay鼠是研究T2DM高胰島素和高瘦素機理的理想模型。

根據參考文獻及我們的預實驗確定,PNS給藥12d即出現有統計學意義的降糖效果,所以Rb1、Rg1、Rd、Re、R1組連續給藥12d,即可達到觀察哪一成分是PNS中主要降血糖成分。而PNS給藥30d是為觀察它的持續降血糖效應,所以我們選擇PNS給藥30d。

PNS治療30d后,KK-Ay鼠的血清胰島素水平和胰島素抵抗指數均下降,并伴隨FBG和糖耐量的改善,表明了血糖的降低是由胰島素的敏感性增加引起,提示PNS可能是通過提高胰島素的敏感性來降低KK-Ay鼠的血糖。胰島素抵抗會影響胰島素在各重要靶器官中對糖的利用,因而引起高糖血癥和高脂酸血癥,而高糖血癥和高脂酸血癥又會刺激胰島素的分泌并加重胰島素抵抗。長期的高血糖可導致機體三大物質代謝紊亂,并發代謝綜合征,還能引起β-細胞對葡萄糖濃度變化的敏感性及對高血糖的反應性下降,這種狀態被稱作葡萄糖毒性作用。本實驗表明PNS能夠有效的提高KK-Ay鼠對胰島素的敏感性并促進葡萄糖利用:PNS給藥12dFBG下降,給藥30d血清胰島素水平和IRI也出現下降,PNS能夠使FBG維持在較低水平,對KK-Ay鼠血糖長期地調節,從而抑制高血糖正反饋調節并改善胰島素分泌失調。據報道,脂聯素是一種重要的內源性胰島素超敏化激素,能改善胰島素抗性和降低血糖及甘油三酯水平,本研究中PNS有胰島素增敏和降糖、降甘油三酯作用,PNS是否通過提高脂聯素含量從而增加胰島素敏感性,有待我們進一步的研究探討。

本實驗的另一結果提示PNS通過提高KK-Ay鼠對瘦素的敏感性,起到抗肥胖癥的作用。已有研究表明瘦素在體質量的負反饋調節圈中作為導入信號,使機體熱量攝取下降并提高能量消耗。實驗中,與模型組相比,PNS組瘦素水平的下降未引起攝食量、脂肪質量和體質量的增加,而是使這些指標降低,表明瘦素調節食欲和能量消耗的敏感性提高了。肥胖伴隨高水平的瘦素是導致瘦素抵抗的主要原因,瘦素抵抗又會加重肥胖,進而形成代謝紊亂的惡性循 環,調 節 瘦 素 水 平 和 瘦 素 敏 感 性 對 治 療T2DM這類代謝綜合征極其重要。因此,PNS這類既能降低瘦素水平又能改善瘦素抵抗的藥物應得到更多的關注。肥胖是引發T2DM的主要原因之一,已有研究表明肥胖能夠增加細胞內質網壓力,而細胞內質網壓力的增加又會引起c-Jun氮末端激酶〔c-Jun N-terminal kinase\\(JNK\\)〕的超活化以及由之 引 發 的 胰 島 素 受 體 底 物-1〔insulin receptorsubstrate-1\\(IRS-1\\)〕的絲氨酸磷酸化,從而導致胰島素受體信號傳導阻斷。本研究發現,PNS治療30d后,血清甘油三酯水平及附睪脂肪墊質量降低,表明PNS能夠改善T2DM患者代謝平衡,血清甘油三酯水平降低及脂肪的減少也是機體能量消耗增強的標志。由于大多數T2DM患者存在高脂血癥和代謝紊亂,PNS在這方面的治療效果有重要的臨床意義?？傊甈NS通過控制肥胖癥進而提高胰島素的活性,預防T2DM的形成,具有重要的臨床應用前景。

本實 驗 根 據PNS中 各 皂 苷 含 量,拆 分 進 行PNS中各皂苷的降血糖作用研究,以尋找對PNS降血糖功效起主要作用的成份,發現Rb1可能為PNS發揮降血糖作用的主要成分。單獨使用五種皂苷中的任一成分均無抗肥胖作用,該作用可能是由合用五種皂苷或PNS中的其他成分產生。給藥12d后Rb1組FBG下降,其體內降血糖作用與Park等的體外研究相一致。根據Shang等的研究,Rb1在體內可能是通過PPARγ發揮藥理作用。高鈞等的研究得出Re對SD大鼠有降血糖作用,而本實驗中Re降血糖作用不明顯,這可能與實驗采用不同的動物模型及劑量較小等有關。Rd、Rg1、R1給藥12d后無明顯的降血糖作用,由于各成分的給藥劑量均比PNS的給藥劑量\\(200mg/kg體質量\\)小,因此并不能過早的斷定Rd、Rg1、R1無抗糖尿病作用。我們將進一步實驗考察Re、Rd、Rg1、R1在更高劑量下的抗糖尿病作用。

綜上,PNS對KK-Ay鼠有抗高血糖和抗肥胖的治療作用,作用機理是提高胰島素敏感性并降低瘦素抵抗。T2DM伴有肥胖的患者較非肥胖的糖尿病患者瘦素及胰島素抵抗更為嚴重,因此同時具有抗高血糖和抗肥胖癥作用的藥物對其治療效果更好。