復方丹參方（Composite Salvla Recipe,CSR）由丹參、三七、冰片3味藥材組成，具活血化瘀、理氣止痛之功效，在治療冠心病、心絞痛方面療效確切.有研究表明，復方丹參方可以抗大鼠心肌缺血，使心肌缺血再灌注大鼠的心肌梗死面積減少，增強超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低丙二醛（MDA）的量，有保護心臟的作用.
細胞色素P450酶（CYPs）是一種多功能酶系，是生物體內參與內源性化合物（激素、脂肪酸）和外源性化合物（藥物、前致癌物和前毒物）主要生物轉化的酶系.CYPs是存在于多酶系統中末端結合于膜的氧化酶，決定酶系底物的專一性，在整個酶系功能中起著尤為關鍵的作用，多表達于肝臟，目前已知約1000種CYPs,主要分為17個家族，可進一步分為許多亞族與亞型。人體內約有75%的藥物通過CYPs代謝.近年來許多CYPs家族在心臟、血管內皮細胞和平滑肌細胞中得以鑒定，同時很多證據顯示內源性物質經CYPs的代謝產物在維持心血管內環境穩態中發揮重要作用.如花生四烯酸可被CYPs環氧酶代謝為環氧二十碳三烯酸（EET）或被CYPsω-羥化酶代謝為20-羥基二十碳四烯酸（20-HETE）.研究表明，CYPs已經確定存在于心臟和血管內，通過抑制選擇性CYPs能夠對心肌缺血和再灌注損傷產生防護作用.
以往對于復方丹參方的藥理機制研究主要集中于執行心血管重要功能的靶點或指標，如氧化損傷、自由基清除、心肌細胞Ca2+變化、脂質代謝及血液流變學和對心肌細胞的保護等方面，未見復方丹參方對心臟CYPs調控的研究，鑒于復方丹參方是治療心血管疾病的臨床常用藥物，同時CYPs在心血管功能中具有重要作用，其對心肌CYPs影響和機制仍不是十分清楚，因此本研究選擇在心血管中表達并且執行重要功能的CYPs第1家族2種亞型、第2家族4種亞型和第6家族6種亞型的CYPs同工酶，利用Real Time PCR（RT-PCR）方法考察連續、長期使用復方丹參方及其單藥對上述亞酶的影響。以評價復方丹參方及其單藥對心臟CYPs亞型的影響，為進一步深入研究復方丹參方以心臟CYPs為靶點的心血管藥理效應的機制提供線索，同時為指導臨床合理聯合用藥提供實驗依據。
1、材料
1.1 儀器
DY89-1勻漿機（寧波新芝生物科技有限公司），制冰機（ManitowocQM20），PCR儀（GeneAmp2400），核酸蛋白分析儀（BeckmanDU640），超低溫冰箱（Sanyo MDF-U53V），高速低溫離心機（HeraeusLabofuge400R），Step One Plus TM Real Time PCR儀（Applied Biosy stems）。
1.2 藥品與試劑
丹參、三七、冰片藥材均購自安徽綠源公司，并經軍事醫學科學院放射醫學研究所藥理毒理研究所馬百平教授鑒定為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，五加科植物三七Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根莖，合成龍腦。1000粒復方丹參滴丸的組成：丹參90g、三七17.6g、冰片1g,參考《中國藥典》2010年版一部復方丹參滴丸煎煮方法，以上3味藥，丹參、三七加水煎煮，煎液濾過，濾液濃縮，加入乙醇，靜置使沉淀，取上清液，回收乙醇，濃縮成稠膏，加入冰片細粉，再濃縮成1g/mL稠膏，備用.
丹參、三七和冰片的煎煮方法和復方丹參方的煎煮方法一致，濃縮成1g/mL.各水煎液用時以蒸餾水配制。超純總RNA快速提取試劑盒（北京博邁德生物技術有限公司）；Trans Script TM One-Step RT-PCR Super Mix（北京全式金生物技術有限公司）；Fast SYBR @ Green Master Mix（Applied Bio systems）。其他試劑均為市售分析純。
1.3 動物
雄性SD大鼠，清潔級，體質量180~220g,軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK-（軍）-2007-004.動物常規喂養，自由飲水；飼養室光照10h,黑暗14h,溫度21~25℃，濕度30%~70%.
2、方法
2.1 動物分組及給藥
40只SD大鼠隨機分為5組，每組8只。分別為對照組、復方丹參方組、丹參組、三七組、冰片組。
按《中國藥典》2010年版一部規定的臨床劑量及相關文獻按體表面積折算為大鼠給藥劑量，具體劑量為復方丹參方0.32g/（kg·d）、丹參0.27g/（kg·d）、三七0.05g/（kg·d）、冰片0.003g/（kg·d），ig給藥，對照組給予同等劑量的生理鹽水。每天給藥1次，給藥時間為《中國藥典》2010年版規定的1個療程，即28d.
2.2 心臟CYPs mRNA水平測定
給藥28d后取各處理組大鼠心肌組織，液氮速凍后？80℃保存備用。實驗時取適量心肌組織按試劑盒說明提取心肌組織總RNA,電泳分析表明18S和28S條帶清晰可見，A260/A280值在1.7~2.0,總RNA片段完整未降解可用。取2.0μgRNA按照Trans Script TM One-Step RT-PCR Super Mix說明進行逆轉錄反應，42℃、30min;85℃、5min.用ABI Step One Plus TM Real Time PCR 儀進行PCR反應，取2.0μL逆轉錄反應產物作為PCR反應模板，加入上下游引物20μmol/L各0.5μL,Fast SYBR @ Green Master Mix 10μL,補充Rase-free water至20μL.反應參數：95℃、20s預變性，95℃、3s變性，60℃30s退火，共40個循環。每次擴增設置β-actin內參照，進行PCR擴增產物的實時定量分析，用2?（△△Ct）方法分析。特異性引物序列見表1.
表1
2.3 統計學分析
所有數據重復3次，每次設置3個復孔。實驗數據用x±s表示，采用SAS統計學軟件，兩組間比較采用t檢驗。
3、結果
3.1 復方丹參方對大鼠心臟CYP1家族中CYP1A1和CYP1B1亞型mRNA水平的影響
復方丹參方及其單味藥對大鼠心臟CYP1家族代表亞型mRNA水平的影響結果見圖1.與對照組比較，丹參組、三七組和冰片組對CYP1A1都有下調趨勢（P<0.01）；復方及其單味藥組對CYP1B1都具有下調趨勢（P<0.05、0.01）。
圖1
3.2 復方丹參方對大鼠心臟CYP2家族CYP2B1、CYP2C11、CYP2E1和CYP2J3mRNA水平的影響
對大鼠心臟CYP2家族來說，與對照組比較，復方丹參方組、丹參組、三七組和冰片組對CYP2B1有抑制作用（P<0.05、0.01）；丹參組、三七組和冰片組對CYP2C11有下調趨勢（P<0.01）；而復方丹參方組、丹參組和三七組對CYP2E1有抑制趨勢（P<0.05、0.01）；丹參組和三七組對CYP2J3有下調作用（P<0.01），而復方丹參方組對CYP2J3有上調趨勢。結果見圖2.
圖2
3.3 復方丹參方對大鼠心臟CYP4家族CYP4A1、CYP4A3、CYP4F1、CYP4F4、CYP4F5和CYP4F6mRNA水平的影響
與對照組比較，復方丹參方組對CYP4A1和CYP4F4的mRNA表達有抑制作用（P<0.05）；丹參組對CYP4A1、CYP4F4和CYP4F5亞型的mRNA表達有下調作用（P<0.05、0.01），對CYP4A3、CYP4F1和CYP4F6的mRNA表達有上調趨勢（P<0.05）；三七組對CYP4A1、CYP4A3、CYP4F4、CYP4F5和CYP4F6的mRNA表達均有不同程度的抑制趨勢（P<0.05、0.01）；冰片組對CYP4A1和CYP4F4的mRNA表達有下調趨勢（P<0.01）。結果見圖3.
圖3
4、討論
CYPs最初發現于肝微粒體，其在生物轉化、藥物代謝、解毒等方面研究進行較早且較廣泛，而AA經CYPs途徑的代謝產物對心血管系統的影響近年來日益受到重視，其代謝產物中EETs和20-HETE在調節血管張力和高血壓的發展中有重要影響.大鼠血管內皮、心肌組織和平滑肌細胞等富含CYPs表氧化酶（如CYP2C11、CYP2J3等）和羥化酶（如CYP4A1、CYP4F1等），代謝AA分別產生EETs和20-HETE.EETs由血管活性物質如乙酰膽堿、緩激肽、AA促進內皮細胞釋放，通過激活鈣敏感性鉀通道（Ca2+-sensitivepotassiumchannel,Kca）使內皮下的平滑肌細胞發生超級化反應而產生擴血管效應.20-HETE在大鼠中主要由CYPs4家族代謝，這是一種強有力的縮血管物質，對血壓調節有重要影響.
復方丹參方及其單味藥連續ig誘導處理28d后，發現復方丹參方及其單味藥對CYP1A1和CYP1B1有不同程度的抑制作用。有文獻報道，在一定程度內，吸煙者的CYP1A1的基因變異體增加了心血管疾病的風險性，同時可能提高動脈粥樣硬化的發病率;心力衰竭時，CYP1B1的表達會上調,這說明復方丹參方及其單味藥一定程度上減少心血管疾病發生的概率。CYP2J2/3主要表達于心臟，且主要合成具有心臟保護作用的EETs.大鼠心臟CYP2J3與人類心臟CYP2J2具有70%的同源性。復方丹參方對大鼠CYP2J3有誘導趨勢，而單味藥組對其是抑制趨勢，復方對心臟的保護作用強于單味藥，有增效作用。Bhatnagar研究發現CYP2J對心臟表現為保護作用，而CYP2C則表現為加重損傷，提出CYPs不同亞型可能產生氧自由基不同，而表現為加重或拮抗心肌缺血/再灌注損傷。本研究中復方丹參方及其單味藥組對CYP2B1、CYP2C11和CYP2E1都有不同程度的下調作用，從一個側面支持了Bhatnagar的觀點。復方丹參方及其單味藥組對大鼠心臟CYP4A1、CYP4A3、CYP4F1、CYP4F4、CYP4F5和CYP4F6亞型mRNA水平，有不同程度的誘導或者抑制趨勢，這說明復方丹參方及其單味藥對血壓的調節可能是一個雙向的作用，從而支持中藥復方對機體是雙向調節的作用，維持機體的平衡。復方丹參方和單味藥對心臟CYPsmRNA表達影響的貢獻度不同，例如丹參、三七和冰片對CYP1A1和CYP2J3都有抑制趨勢，而復方丹參方對其是誘導趨勢，說明復方及其單味藥對這兩種亞型CYPsmRNA表達影響的貢獻度不同。丹參、三七和冰片對CYP1A1和CYP1B1都有抑制作用，但配伍后，復方對這兩個的亞型的抑制作用減弱。三七對這12種亞型都有不同程度抑制作用，而丹參和冰片對12種亞型有不同的誘導或者抑制作用，從結果來看，初步推測出對CYPs抑制作用的貢獻度主要來自三七，而對其有誘導作用的貢獻度主要來自丹參和冰片。另外，配伍后，復方丹參方全方對心臟CYPsmRNA表達影響弱于方中各單藥對心臟CYPs的影響，顯示復方對心臟CYPs影響可能是各單味藥作用的綜合和疊加。
復方丹參方及其單味藥的成分復雜，對大鼠心臟CYPs酶不同的亞型有不同程度的誘導或者抑制作用，而不同的亞型對心臟血管有不同的收縮或者舒張作用，復方丹參方及其單藥對心臟有一定的保護作用，并且其保護可能是雙向的調節作用，以達到機體的平衡。（圖標略）
