[摘要] 目的 百草枯能夠導致肺纖維化發生發展，但其發生機制尚不明確。文中探討 Wnt/β-catenin 信號通路在百草枯致肺纖維化發生發展中的作用。 方法 SD 雄性大鼠 48 只，隨機數字表法分為對照組和百草枯中毒組，每組 24 只。百草枯中毒組大鼠腹腔注射百草枯 30mg/kg 建立肺纖維化模型，對照組腹腔注射等量等滲鹽水。于百草枯中毒后 14 d 和 28 d 斷頸處死各組大鼠，剪取肺組織，HE 染色和馬松染色檢測肺纖維化程度，Western blot 檢測 Wnt/β-catenin 信號通路關鍵蛋白β-catenin的表達水平。培養人肺上皮細胞，實驗分為 3 組，空白對照組： 不作任何處理； 百草枯組： 給予 50 μmol/L 的百草枯處理 3d; 抑制劑組： 給予 50μmol/L 的百草枯處理，同時給予 Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑 DKK-1 20ng/mL 處理 3d.采用免疫熒光和 Western blot 檢測 Wnt/β-catenin 信號通路關鍵蛋白 β-catenin 的表達水平，qRT-PCR 檢測肺上皮細胞標記 E-Cadherin、Occludin 和成纖維細胞標記蛋白 α-SMA、Vimentin 表達水平。 結果 大鼠百草枯中毒后，HE 染色和馬松染色結果顯示，肺泡壁增厚，肺泡結構紊亂，膠原蛋白沉積，肺纖維化發生； Western blot 檢測結果表明，與對照組大鼠相比，百草枯中毒組大鼠中毒 14d β-catenin 的表達水平顯著升高[（ 0.38±0.04） vs （ 0.67±0.06） ,P<0.01],中毒 28 d 時高達（ 1.05±0.08） ,升高更為明顯（ P<0.01） .與空白對照組相比，百草枯組 E-Cadherin、Occludin 表達水平顯著下降（ P<0.01） ,成纖維細胞標記 α-SMA、Vimentin表達水平顯著升高（ P<0.01） ; 而百草枯組相比，抑制劑組 α-SMA 和 Vimentin 表達水平顯著下降，E-cadherin 和 Occludin 的表達水平顯著上升（ P<0.01） . 結論 百草枯染毒導致大鼠肺纖維化發生，并導致肺組織 Wnt/β-catenin 信號通路激活，而阻斷 Wnt/β-catenin 信號通路能夠抑制百草枯誘導的上皮-間質發生，證實 Wnt/β-catenin 信號通路在百草枯致肺纖維化發生發展中起著重要的調控作用。
[關鍵詞] 百草枯； 肺纖維化； Wnt/β-catenin 信號通路； 上皮-間質轉化。
0 引 言。
百草枯目前仍是世界范圍內廣泛使用的有機雜環類除草劑。在我國，口服百草枯致死率可達60.0% ~87.5%[1-2].百草枯中毒的主要的靶器官是肺，其特征性改變是肺損傷，早期表現為肺泡上皮細胞受損，炎癥浸潤，晚期則出現肺泡和肺間質的纖維化，患者最終死于呼吸衰竭[3-4].百草枯能夠導致肺組織內大量炎性因子和細胞因子表達，激活相關信號通路，從而導致肺纖維化的發生發展[5].有研究表明： Wnt/β-catenin 信號通路在肺纖維化的發生發展過程中起著重要的調控作用； 高度激活的 Wnt/β-catenin 信號通路能夠促進肺成纖維細胞、肺上皮細胞、干細胞轉分化為肌成纖維細胞 （ Myofibro-blasts） ,促進膠原蛋白沉積，從而導致肺纖維化的發生發展[6-8].Wnt/β-catenin 信號通路在百草枯導致的肺纖維化發生發展中的作用并未見詳細報道，本實驗探討 Wnt/β-catenin 信號通路在百草枯致肺纖維化中的調控作用。
1 材料與方法。
1.1 實驗材料 人肺上皮細胞（ 16HBE） 購自中國科學院上海細胞庫。百草枯試劑（ 美國 Sigma 公司） ,重組 DKK1 細胞因子（ 美國 PeproTech 公司） ,β-catenin 和 β-actin 抗體（ 英國 Abcam 公司） ,熒光二抗 Alexa Fluor 488（ 美國 Life Technologies 公司） .qRT-PCR 試劑盒（ 加拿大 Fermentas 公司） .
1.2 實驗動物分組 健康清潔級 SD 大鼠 48 只，體重 180~220 g,由我院比較醫學科提供，實驗動物合格證號： CXK（ 軍） 2007-2012.按標準飲食喂養，飼養溫度（ 21±2） ℃，濕度 40% ~ 70%,每日光照和黑暗各 12h.隨機數字表法分為 2 組： 百草枯中毒組： 一次性腹腔注射百草枯溶液 20 mg/kg; 對照組：一次性腹腔注射給予與百草枯中毒組等量的等滲鹽水，各 24 只。于百草枯中毒第 14 天和 28 天后處死各組大鼠，剪取肺組織，進行相關后續實驗。
1.3 肺組織 HE 染色及馬松染色 各組大鼠肺組織剪取右下肺葉，4%多聚甲醛固定 16 h,經梯度脫水，石蠟包埋，做成 4 μm 厚度的切片，按照操作說明，切片進行 HE 染色和馬松染色，在 100 倍光鏡下觀察肺組織結構和膠原蛋白沉積情況。
1.4 人肺上皮細胞 HBE 的培養 無菌條件下 10%FBS 的 DMEM 高糖培養基（ 加入 1% L-谷氨酰胺，1%青鏈霉素） 培養 HBE 細胞，以 1×106個/mL 的密度接種于 100 mm 的細胞培養皿中，置于 37 ℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中，恒溫培養，每 3 天換液 1 次，直至細胞生長至 80%融合。0.25%胰酶-EDTA 消化細胞，以 1 ∶ 3 的比例傳代。
1.5 Western blot 法檢測 Wnt /β-catenin 信號通路關鍵蛋白 β-catenin 的表達情況 百草枯中毒組大鼠肺組織剪取左下肺葉，加入組織 RIPA 裂解液，研磨勻漿后，離心提取上清，Bradford 檢測蛋白濃度，加入 loading buffer 溶液，存于-80 ℃。培養的 HBE細胞分為 3 組，空白對照組： 不作任何處理； 百草枯組： 給予 50 μmol/L 的百草枯處理 3 天； 抑制劑組：給予 50 μmol/L 的百草枯處理，同時給予 Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑 DKK-1 20 ng / mL 處理 3 d.提取各組細胞蛋白，Western blot 檢測 β-catenin 蛋白表達情況。每個樣本取等量蛋白進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，電壓 100 V,100 min,電泳后，進行轉膜，電壓20V,時間 10min.轉膜后，PBS 清洗 3×5min.取出膜，放于封閉液（ 含3% 脫脂奶粉和 0.3% BSA）中，37 ℃ 封閉 2 h.PBST（ 含 0. 05% Tween 20 的PBS） 清洗 1 次，每次 5 min,將膜按照分子量裁成小條，加 入 多 克 隆 兔 抗 β-catenin 和 β-actin 抗 體（ 1 ∶3000） ,4 ℃ 孵育過夜后用適量 PBST 清洗6×5min.將膜又分別浸入 1 ∶ 10 000 的帶 HRP 標記的羊抗兔二抗，室溫孵育 1 h 后用適量 PBST 清洗6×5min.ECL 顯色。Fluor Chem FC2 成像系統采集圖像，Image J 軟件進行灰度值分析。
1.6 免疫熒光技術檢測 HBE 上皮細胞 β-catenin蛋白的表達情況 將空白對照組、百草枯組、抑制劑組細胞在預冷的 4%多聚甲醛中固定 10min,PBS 清洗 2 次。0.1% Triton-X 100 進行 10 min 的穿孔處理，PBS 清洗 2 次。加入 3% BSA 37℃封閉 1h.一抗（ β-catenin） 4 ℃ 孵育過夜。PBS 清洗 3 次，羊抗兔 Alexa Fluor 488 的二抗（ 1 ∶200） 37 ℃ 孵育 1 h.PBS 清洗 6 次，細胞核用 DAPI （ 5 μg / mL） 常溫下孵育 6min,PBS 清洗 6 次。90%甘油封固，激光共聚焦顯微鏡下拍照。
1.7 qRT-PCR 技術檢測 HBE 上皮細胞標記 E-Cadherin、Occludin 和成纖維細胞標記 α-SMA、Vim-entin 基因表達水平 采用 TRIZOL 提取法提取空白對照組、百草枯組、抑制劑組細胞 RNA,進行逆轉錄后，RT-PCR 試劑盒逆轉錄得到 cDNA.取 1 μL 逆轉錄得到的 cDNA 進行 qRT-PCR 實驗，檢測 E-Cadher-in、Occludin、α-SMA 和 Vimentin 基因的表達水平。選擇 18sRNA 為內參基因，目的基因引物序列來自基因數據庫，引物序列為 18sRNA 正向： CTCCATCTTG-GCATCGCTGT; 反 向： GCTGTCGCCTTTACAGTTCC;E-Cadherin 正 向： GCGCTCCCCTCAGATGGTGTC; 反向： ACGATGGCCGGCTTGTTGC; Occludin 正向： GCT-CAGGGAATATCCACCTATCA; 反 向： CACAAAGTTT-TAACTTCCCAGACG; α-SMA 正向： GCATCCGACCTT-GCTAACG; 反 向： TCTCCAGAGTCCAGCACAATAC-CAG; Vimentin 正 向： ACATCCACCCGCACCTAC; 反向： CAACTCCCTCATCTCCTCCTC.均由上海生工生物工程有限公司合成。融解曲線鑒定產物特異性，每個樣品重復測定 3 次。反應體系如下： 2×AB Mix5 μL,10 μmol / L 上下游引物各 0.25 μL,cDNA 1 μL,水 3.5μL.擴增條件為 95℃預變性 10 min,95 ℃變性 15s,60℃退火延伸 60s,共40 個循環。將對照組mRNA 水平設為 1.
1.8 統計學分析 采用 SPSS 18.0 軟件進行統計分析。定量資料用均數±標準差（ x±s） 表示，多組均數比較用單因素方差分析，兩兩組間比較采用 SNK 檢驗。以 P≤0.05 為差異有統計學意義。
[關鍵詞] 百草枯； 肺纖維化； Wnt/β-catenin 信號通路； 上皮-間質轉化。
0 引 言。
百草枯目前仍是世界范圍內廣泛使用的有機雜環類除草劑。在我國，口服百草枯致死率可達60.0% ~87.5%[1-2].百草枯中毒的主要的靶器官是肺，其特征性改變是肺損傷，早期表現為肺泡上皮細胞受損，炎癥浸潤，晚期則出現肺泡和肺間質的纖維化，患者最終死于呼吸衰竭[3-4].百草枯能夠導致肺組織內大量炎性因子和細胞因子表達，激活相關信號通路，從而導致肺纖維化的發生發展[5].有研究表明： Wnt/β-catenin 信號通路在肺纖維化的發生發展過程中起著重要的調控作用； 高度激活的 Wnt/β-catenin 信號通路能夠促進肺成纖維細胞、肺上皮細胞、干細胞轉分化為肌成纖維細胞 （ Myofibro-blasts） ,促進膠原蛋白沉積，從而導致肺纖維化的發生發展[6-8].Wnt/β-catenin 信號通路在百草枯導致的肺纖維化發生發展中的作用并未見詳細報道，本實驗探討 Wnt/β-catenin 信號通路在百草枯致肺纖維化中的調控作用。
1 材料與方法。
1.1 實驗材料 人肺上皮細胞（ 16HBE） 購自中國科學院上海細胞庫。百草枯試劑（ 美國 Sigma 公司） ,重組 DKK1 細胞因子（ 美國 PeproTech 公司） ,β-catenin 和 β-actin 抗體（ 英國 Abcam 公司） ,熒光二抗 Alexa Fluor 488（ 美國 Life Technologies 公司） .qRT-PCR 試劑盒（ 加拿大 Fermentas 公司） .
1.2 實驗動物分組 健康清潔級 SD 大鼠 48 只，體重 180~220 g,由我院比較醫學科提供，實驗動物合格證號： CXK（ 軍） 2007-2012.按標準飲食喂養，飼養溫度（ 21±2） ℃，濕度 40% ~ 70%,每日光照和黑暗各 12h.隨機數字表法分為 2 組： 百草枯中毒組： 一次性腹腔注射百草枯溶液 20 mg/kg; 對照組：一次性腹腔注射給予與百草枯中毒組等量的等滲鹽水，各 24 只。于百草枯中毒第 14 天和 28 天后處死各組大鼠，剪取肺組織，進行相關后續實驗。
1.3 肺組織 HE 染色及馬松染色 各組大鼠肺組織剪取右下肺葉，4%多聚甲醛固定 16 h,經梯度脫水，石蠟包埋，做成 4 μm 厚度的切片，按照操作說明，切片進行 HE 染色和馬松染色，在 100 倍光鏡下觀察肺組織結構和膠原蛋白沉積情況。
1.4 人肺上皮細胞 HBE 的培養 無菌條件下 10%FBS 的 DMEM 高糖培養基（ 加入 1% L-谷氨酰胺，1%青鏈霉素） 培養 HBE 細胞，以 1×106個/mL 的密度接種于 100 mm 的細胞培養皿中，置于 37 ℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中，恒溫培養，每 3 天換液 1 次，直至細胞生長至 80%融合。0.25%胰酶-EDTA 消化細胞，以 1 ∶ 3 的比例傳代。
1.5 Western blot 法檢測 Wnt /β-catenin 信號通路關鍵蛋白 β-catenin 的表達情況 百草枯中毒組大鼠肺組織剪取左下肺葉，加入組織 RIPA 裂解液，研磨勻漿后，離心提取上清，Bradford 檢測蛋白濃度，加入 loading buffer 溶液，存于-80 ℃。培養的 HBE細胞分為 3 組，空白對照組： 不作任何處理； 百草枯組： 給予 50 μmol/L 的百草枯處理 3 天； 抑制劑組：給予 50 μmol/L 的百草枯處理，同時給予 Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑 DKK-1 20 ng / mL 處理 3 d.提取各組細胞蛋白，Western blot 檢測 β-catenin 蛋白表達情況。每個樣本取等量蛋白進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，電壓 100 V,100 min,電泳后，進行轉膜，電壓20V,時間 10min.轉膜后，PBS 清洗 3×5min.取出膜，放于封閉液（ 含3% 脫脂奶粉和 0.3% BSA）中，37 ℃ 封閉 2 h.PBST（ 含 0. 05% Tween 20 的PBS） 清洗 1 次，每次 5 min,將膜按照分子量裁成小條，加 入 多 克 隆 兔 抗 β-catenin 和 β-actin 抗 體（ 1 ∶3000） ,4 ℃ 孵育過夜后用適量 PBST 清洗6×5min.將膜又分別浸入 1 ∶ 10 000 的帶 HRP 標記的羊抗兔二抗，室溫孵育 1 h 后用適量 PBST 清洗6×5min.ECL 顯色。Fluor Chem FC2 成像系統采集圖像，Image J 軟件進行灰度值分析。
1.6 免疫熒光技術檢測 HBE 上皮細胞 β-catenin蛋白的表達情況 將空白對照組、百草枯組、抑制劑組細胞在預冷的 4%多聚甲醛中固定 10min,PBS 清洗 2 次。0.1% Triton-X 100 進行 10 min 的穿孔處理，PBS 清洗 2 次。加入 3% BSA 37℃封閉 1h.一抗（ β-catenin） 4 ℃ 孵育過夜。PBS 清洗 3 次，羊抗兔 Alexa Fluor 488 的二抗（ 1 ∶200） 37 ℃ 孵育 1 h.PBS 清洗 6 次，細胞核用 DAPI （ 5 μg / mL） 常溫下孵育 6min,PBS 清洗 6 次。90%甘油封固，激光共聚焦顯微鏡下拍照。
1.7 qRT-PCR 技術檢測 HBE 上皮細胞標記 E-Cadherin、Occludin 和成纖維細胞標記 α-SMA、Vim-entin 基因表達水平 采用 TRIZOL 提取法提取空白對照組、百草枯組、抑制劑組細胞 RNA,進行逆轉錄后，RT-PCR 試劑盒逆轉錄得到 cDNA.取 1 μL 逆轉錄得到的 cDNA 進行 qRT-PCR 實驗，檢測 E-Cadher-in、Occludin、α-SMA 和 Vimentin 基因的表達水平。選擇 18sRNA 為內參基因，目的基因引物序列來自基因數據庫，引物序列為 18sRNA 正向： CTCCATCTTG-GCATCGCTGT; 反 向： GCTGTCGCCTTTACAGTTCC;E-Cadherin 正 向： GCGCTCCCCTCAGATGGTGTC; 反向： ACGATGGCCGGCTTGTTGC; Occludin 正向： GCT-CAGGGAATATCCACCTATCA; 反 向： CACAAAGTTT-TAACTTCCCAGACG; α-SMA 正向： GCATCCGACCTT-GCTAACG; 反 向： TCTCCAGAGTCCAGCACAATAC-CAG; Vimentin 正 向： ACATCCACCCGCACCTAC; 反向： CAACTCCCTCATCTCCTCCTC.均由上海生工生物工程有限公司合成。融解曲線鑒定產物特異性，每個樣品重復測定 3 次。反應體系如下： 2×AB Mix5 μL,10 μmol / L 上下游引物各 0.25 μL,cDNA 1 μL,水 3.5μL.擴增條件為 95℃預變性 10 min,95 ℃變性 15s,60℃退火延伸 60s,共40 個循環。將對照組mRNA 水平設為 1.
1.8 統計學分析 采用 SPSS 18.0 軟件進行統計分析。定量資料用均數±標準差（ x±s） 表示，多組均數比較用單因素方差分析，兩兩組間比較采用 SNK 檢驗。以 P≤0.05 為差異有統計學意義。
