摘要： 目的：探究細胞焦亡在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的變化及作用機制。方法：選擇成年健康雄性SD大鼠，體重210-230g.大鼠糖尿病模型采用腹腔注射1%鏈脲佐菌素60mg/kg制備，取造模成功的SD大鼠40只，將其隨機分為2組（n=20）：糖尿病假手術組（DS組）、糖尿病心肌缺血再灌注組（DIR組）；另取非糖尿病大鼠40只，將其隨機分為2組（n=20）：假手術組（NS組）、心肌缺血再灌注組（NIR組）。采用結扎左冠狀動脈前降支30min再灌注120min的方法制備心肌缺血再灌注模型；NS組、DS組只穿線不結扎。再灌注結束后，采集動脈血樣，檢測肌酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脫氫酶（LDH）的活性；采用TTC法檢測心肌梗死面積；HE染色觀察心肌組織病理學變化；Western Blot法檢測NLRP3、caspase-1、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和IL-1β在心肌組織的表達。結果：DS與NS相比，NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達增加；非糖尿病和糖尿病大鼠在心肌缺血再灌注時，CK-MB和LDH的活性增加，NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達增加；DIR組與NIR相比，心臟病理學損傷加重，心肌梗死面積增加，CK-MB和LDH活性增高，NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達增加。結論：糖尿病大鼠心肌對缺血再灌注敏感性增加，缺血再灌注損傷加重，其機制可能與NLRP3介導的caspase-1依賴性細胞焦亡的作用密切相關。
糖尿病合并缺血性心臟疾病患者，在經皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈旁路移植術治療時可導致心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）損傷。研究表明，糖尿病患者心肌缺血再灌注損傷的發病率不僅高于非糖尿病患者，且心肌受損程度更為嚴重、預后更差、死亡率更高[1].糖尿病合并心肌缺血再灌注時，心肌細胞壞死和凋亡是其損傷加重和敏感性增加的重要原因[2].細胞焦亡是近年發現的一種新的促炎程序性細胞死亡方式，最主要的生物學特征是依賴于半胱天冬酶-1（caspase-1）并伴隨炎癥級聯反應，在內源性和外源性刺激作用下，凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like proteincontaining,ASC）作用于pro-caspase-1形成炎性小體并激活pro-caspase-1,活化的caspase-1誘導下游細胞因子白細胞介素（interleukin,IL）-1β、IL-18活化，細胞釋放乳酸脫氫酶（LDH）等胞內物質，介導組織細 胞 損 傷[3]. 研 究 表 明，大 鼠 糖 尿 病 心 肌 中caspase-1的mRNA水平和蛋白質的表達顯著增加[4],進 一 步 研 究 發 現NLRP3炎 性 小 體 激 活caspase-1介導的細胞焦亡在糖尿病性心肌?。╠ia-betic cardiomyopathy,DCM）發生發展中起重要作用[5].研究發現，腎小管上皮細胞缺血再灌注時，caspase-1和IL-1β表達增加，證實細胞焦亡是腎小管上皮細胞I/R損傷的重要機制[6].然而caspase-1依賴的細胞焦亡是否參與糖尿病心肌缺血再灌注損傷，caspase-1依賴的細胞焦亡是否介導增加糖尿病心肌缺血再灌注損傷的敏感性和易損性尚未見報道。本研究擬探究caspase-1依賴的細胞焦亡在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及可能機制。
1 材料與方法。
1.1 動物及分組 SPF級健康成年雄性SD大鼠，體重210-230g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。適應性觀察1周，禁食12h后經腹腔注射l%鏈脲佐菌素-檸檬酸鹽緩沖液（Sigma公司，美國）60mg/kg,3d后禁食6h,斷尾取血測空腹血糖，若血糖值>16.7mmol/L,并出現多飲、多食、多尿即糖尿病大鼠模型制備成功。此后每周測定一次空腹血糖和體重，普食飼養8周。非糖尿病大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。取非糖尿病和糖尿病大鼠各40只，采用隨機數字表法，分別將其分為兩個亞組（n=20）：正常假手術組（NS組）、正常心肌缺血再灌注組（NIR組）、糖尿病假手術組（DS組）、糖尿病心肌缺血再灌注組（DIR組）。
1.2 心肌I/R模型 大鼠術前禁食12h,采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉固定大鼠。大鼠氣管插管后接動物呼吸機行機械通氣，皮下電極監測Ⅱ導聯心電圖。于左鎖骨中線第四肋間打開胸腔暴露心臟，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間左冠狀動脈前降支（LAD）起始部下3mm處以6-0尼龍線結扎，缺血30min,松開結扎線再灌注120min,假手術組只穿線不接扎。判斷缺血成功的標準：心尖部及左心室前壁變白，心電圖示QRS波增寬，ST段抬高，T波高尖，心室壁運動減弱；再灌注成功的標準：心尖部位及左心室前壁恢復紅色，心電圖示ST段回落。
1.3 心肌梗死面積測定 每組分別在再灌注結束后隨機取6只大鼠，再次結扎LAD,股靜脈穿刺注射3%伊文斯藍1ml,至大部分心臟藍染后取出心臟，置于-20℃保存2h,于心臟垂直于長軸方向將心臟切成2mm厚的薄片，用PBS配制的1%TTC溶液（sigma公司，美國）37 ℃避光孵育15min,4%多聚甲醛固定20min,用掃描儀拍片。采用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件分析，正常心肌呈藍色，缺血心肌呈磚紅色，梗死心肌呈灰白色，分析測定心肌缺血面積和梗死面積。
1.4 CK-MB和LDH檢測 再灌注120min后，采集動脈血樣，離心后取血清，按照CK-MB、LDH活性檢測試劑盒說明測定CK-MB含量和LDH活性。
1.5 HE染色 于再灌注120min結束后，取缺血區心尖部心肌組織，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后于切片機上切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理結果。
1.6 Western Blot 法 檢 測 心 肌 組 織NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β的表達于再灌注120min結束時，每組取8只大鼠，處死后取左室心肌缺血區心肌組織100mg,用冰PBS灌洗干凈后，加入1 000μlRIPA裂解液，冰上靜置30min,再冰浴電動勻漿，4℃下12 000 g離心15min,取上清，用BCA法測定蛋白濃度。加5×上樣緩沖液混勻煮沸10 min.Western Blot進行蛋白定量檢測，分別用10%分離膠和5%濃縮膠、15%分離膠和5%濃縮膠進行電泳，于PVDF膜上進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h,分別用NLRP3多克隆抗體（1∶200,Novus公司，美國）、caspase-1多克隆抗體（稀釋度1∶200,Santa公司，美國）、ASC多克隆抗體（稀釋度1∶200,Santa公司，美國）和IL-1β多克隆抗體（稀釋度1∶1 000,Abcam公司，美國）進行4℃過夜孵育。TBST洗滌3次，每次10min,用山羊抗兔多克隆熒光二抗（稀釋度1∶10 000,Li-Cor公司，美國）室溫孵育1h,TBST洗滌3次，每次10min.用Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀（Li-Cor公司，美國）掃描熒光蛋白條帶，用Odyssey系統軟件進行結果分析，通過目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。
1.7 統計學處理 采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x珔±s）表示，兩組比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果。
2.1 心肌梗死面積與假手術組比較，缺血再灌注組心肌梗死面積百分比明顯增大（P<0.05）；與正常心肌缺血再灌注組相比，糖尿病心肌缺血再灌注組心肌梗死面積百分比增加（P<0.05），見圖1、表1.
2.2 CK-MB和LDH活性 與假手術組比較，缺血再灌注組血清CK-MB和LDH的活性升高（P<0.05）；與正常心肌缺血再灌注組相比，糖尿病心肌缺血再灌注 組血清CK-MB和LDH的 活 性 升 高（P<0.05），見表2.
糖尿病合并缺血性心臟疾病患者，在經皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈旁路移植術治療時可導致心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）損傷。研究表明，糖尿病患者心肌缺血再灌注損傷的發病率不僅高于非糖尿病患者，且心肌受損程度更為嚴重、預后更差、死亡率更高[1].糖尿病合并心肌缺血再灌注時，心肌細胞壞死和凋亡是其損傷加重和敏感性增加的重要原因[2].細胞焦亡是近年發現的一種新的促炎程序性細胞死亡方式，最主要的生物學特征是依賴于半胱天冬酶-1（caspase-1）并伴隨炎癥級聯反應，在內源性和外源性刺激作用下，凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like proteincontaining,ASC）作用于pro-caspase-1形成炎性小體并激活pro-caspase-1,活化的caspase-1誘導下游細胞因子白細胞介素（interleukin,IL）-1β、IL-18活化，細胞釋放乳酸脫氫酶（LDH）等胞內物質，介導組織細 胞 損 傷[3]. 研 究 表 明，大 鼠 糖 尿 病 心 肌 中caspase-1的mRNA水平和蛋白質的表達顯著增加[4],進 一 步 研 究 發 現NLRP3炎 性 小 體 激 活caspase-1介導的細胞焦亡在糖尿病性心肌?。╠ia-betic cardiomyopathy,DCM）發生發展中起重要作用[5].研究發現，腎小管上皮細胞缺血再灌注時，caspase-1和IL-1β表達增加，證實細胞焦亡是腎小管上皮細胞I/R損傷的重要機制[6].然而caspase-1依賴的細胞焦亡是否參與糖尿病心肌缺血再灌注損傷，caspase-1依賴的細胞焦亡是否介導增加糖尿病心肌缺血再灌注損傷的敏感性和易損性尚未見報道。本研究擬探究caspase-1依賴的細胞焦亡在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及可能機制。
1 材料與方法。
1.1 動物及分組 SPF級健康成年雄性SD大鼠，體重210-230g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。適應性觀察1周，禁食12h后經腹腔注射l%鏈脲佐菌素-檸檬酸鹽緩沖液（Sigma公司，美國）60mg/kg,3d后禁食6h,斷尾取血測空腹血糖，若血糖值>16.7mmol/L,并出現多飲、多食、多尿即糖尿病大鼠模型制備成功。此后每周測定一次空腹血糖和體重，普食飼養8周。非糖尿病大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。取非糖尿病和糖尿病大鼠各40只，采用隨機數字表法，分別將其分為兩個亞組（n=20）：正常假手術組（NS組）、正常心肌缺血再灌注組（NIR組）、糖尿病假手術組（DS組）、糖尿病心肌缺血再灌注組（DIR組）。
1.2 心肌I/R模型 大鼠術前禁食12h,采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉固定大鼠。大鼠氣管插管后接動物呼吸機行機械通氣，皮下電極監測Ⅱ導聯心電圖。于左鎖骨中線第四肋間打開胸腔暴露心臟，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間左冠狀動脈前降支（LAD）起始部下3mm處以6-0尼龍線結扎，缺血30min,松開結扎線再灌注120min,假手術組只穿線不接扎。判斷缺血成功的標準：心尖部及左心室前壁變白，心電圖示QRS波增寬，ST段抬高，T波高尖，心室壁運動減弱；再灌注成功的標準：心尖部位及左心室前壁恢復紅色，心電圖示ST段回落。
1.3 心肌梗死面積測定 每組分別在再灌注結束后隨機取6只大鼠，再次結扎LAD,股靜脈穿刺注射3%伊文斯藍1ml,至大部分心臟藍染后取出心臟，置于-20℃保存2h,于心臟垂直于長軸方向將心臟切成2mm厚的薄片，用PBS配制的1%TTC溶液（sigma公司，美國）37 ℃避光孵育15min,4%多聚甲醛固定20min,用掃描儀拍片。采用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件分析，正常心肌呈藍色，缺血心肌呈磚紅色，梗死心肌呈灰白色，分析測定心肌缺血面積和梗死面積。
1.4 CK-MB和LDH檢測 再灌注120min后，采集動脈血樣，離心后取血清，按照CK-MB、LDH活性檢測試劑盒說明測定CK-MB含量和LDH活性。
1.5 HE染色 于再灌注120min結束后，取缺血區心尖部心肌組織，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后于切片機上切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理結果。
1.6 Western Blot 法 檢 測 心 肌 組 織NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β的表達于再灌注120min結束時，每組取8只大鼠，處死后取左室心肌缺血區心肌組織100mg,用冰PBS灌洗干凈后，加入1 000μlRIPA裂解液，冰上靜置30min,再冰浴電動勻漿，4℃下12 000 g離心15min,取上清，用BCA法測定蛋白濃度。加5×上樣緩沖液混勻煮沸10 min.Western Blot進行蛋白定量檢測，分別用10%分離膠和5%濃縮膠、15%分離膠和5%濃縮膠進行電泳，于PVDF膜上進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h,分別用NLRP3多克隆抗體（1∶200,Novus公司，美國）、caspase-1多克隆抗體（稀釋度1∶200,Santa公司，美國）、ASC多克隆抗體（稀釋度1∶200,Santa公司，美國）和IL-1β多克隆抗體（稀釋度1∶1 000,Abcam公司，美國）進行4℃過夜孵育。TBST洗滌3次，每次10min,用山羊抗兔多克隆熒光二抗（稀釋度1∶10 000,Li-Cor公司，美國）室溫孵育1h,TBST洗滌3次，每次10min.用Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀（Li-Cor公司，美國）掃描熒光蛋白條帶，用Odyssey系統軟件進行結果分析，通過目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。
1.7 統計學處理 采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x珔±s）表示，兩組比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果。
2.1 心肌梗死面積與假手術組比較，缺血再灌注組心肌梗死面積百分比明顯增大（P<0.05）；與正常心肌缺血再灌注組相比，糖尿病心肌缺血再灌注組心肌梗死面積百分比增加（P<0.05），見圖1、表1.
2.2 CK-MB和LDH活性 與假手術組比較，缺血再灌注組血清CK-MB和LDH的活性升高（P<0.05）；與正常心肌缺血再灌注組相比，糖尿病心肌缺血再灌注 組血清CK-MB和LDH的 活 性 升 高（P<0.05），見表2.
