0引言
進入21世紀以來,隨著計算機技術、分離及分析等技術的進步,多肽組學逐漸成為一門新興熱門學科[1].多肽組學是研究多肽的組成、功能、變化規律與相關關系的學科,是對基因組學和蛋白質組學的補充。然而,多肽組學的研究頗具難度,其復雜的結構和動態變化性對研究人員提出了新的挑戰[2].多肽不僅僅是蛋白質降解的產物,還是重要的生物活性分子,參與了許多生理活動。在心臟方面,多肽組學的研究較少,但多肽在心血管結構和功能中發揮著重要作用[3].
1多肽的定義、命名及分類
多肽通常是指分子量不超過10 k Da的小分子量蛋白,由兩個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽,同理類推還有三肽、四肽、五肽等。通常由三個或三個以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物都可以稱為多肽。根據多肽的來源,可以將其分為內源性生物活性肽和外源性生物活性肽[4].內源性生物活性肽主要是指人體內存在的、天然的生物活性肽。生物活性肽一般以較低豐度表達,特別是在翻譯后可由蛋白水解酶進行位點特異性的降解,這使得對肽的檢測尤為困難[2].外源性生物活性肽主要指動植物、微生物體內的、天然生物活性肽。
2多肽研究的工具
2.1多肽的鑒定 質譜法 (mass spectrometry,MS)是利用電磁學原理,對荷電分子或亞分子片段依其質量和電·荷的比值( 質荷比,M/Z) 進行分離和分析的方法。質譜不僅可以檢測多肽單元的完整信息,還可以同時檢測多肽的數量。在質量分析器中,利用電場或磁場使這些離子發生不同的速度色散,再將它們分別聚焦,進而得到圖譜確定其質量。
2.2多肽的定量 對含量差異微小的多肽樣本進行定量是多肽組學中最重要、也是最具有挑戰性的任務之一[5].不同生理條件下樣品之間肽豐度的差異可以從所測量的肽接收的信號進行統計學的推斷。
2.2.1化學標記法 肽的相對豐度的測量可以通過同重元素標記法,分別在培養的細胞或者動物體內,在肽合成的階段將一種富集同位素的元件打入生長介質或用于標簽的蛋白[6].該方法更適合于在細胞系或低級組織內的標記蛋白。
2.2.2非標記法 非標記法是生物學研究中最廣泛使用的方法,使用非標記法最顯著的一個優點是沒有樣本量的限制[5].非標記法的策略是質譜檢測計數,這項技術認為肽的豐度與每條被檢測的肽的序列呈線性相關。
2.2.3多肽組學的絕對定量 多肽的絕對定量在有參考肽或內源性定量標準的情況下,利用質譜技術可以對多肽進行精確的定量。然而這項技術并未得到廣泛推廣,因為其在使用的過程中需考慮個性化的定量標準。但是對于特定的肽進行定量分析仍不失為一個好的選擇[7].
2.3其他工具 運用在線計算工具對差異多肽的等電點(PI) 和分子質量(MW) 進行描述和分析。 IPA(ingenuity pathway analysis) 軟件: 使用IPA軟件可進一步探索差異表達的多肽及其前體蛋白的生物學意義,對差異多肽及其蛋白前體所參與的經典生物學路徑進行分析[8].
3多肽組學的應用
3.1多肽作為功能學單位 許多病理過程中伴隨著蛋白水解酶的活動,從而影響了多肽組學的研究。此外,一些來自長鏈非編碼RNA編碼的小肽也可以在體內發揮生物學的調節功能。所以,從多肽水平來分析生理-病理生理的改變顯得尤為必要[9].現在對人和鼠中小肽的研究還處于起步階段,目前鑒定了一部分具有生物學功能的小肽。 Anderson等[10]發現了一個長度為46個氨基酸的小肽MLN,能夠與內質網鈣泵SERCA特異性結合,抑制SERCA對Ca2+攝入,調節骨骼肌收縮。研究者們還在一例患有阿爾茨海默病患者的c DNA文庫中,篩選到一個含24個氨基酸殘基的SEP,將其命名為Humanin[11],它可以逆轉由多種阿爾茨海默病相關基因突變所導致的神經細胞凋亡,具有治療阿爾茨海默病的潛能。
3.2多肽作為疾病診斷標志物 大量的肽是在細胞內合成并受到調控的,其中一些則可以在組織內或體液內檢測到,所以對于人體內這些肽的檢測和定量可以作為疾病早期的診斷標志物[2].多肽的動態變化可作為人體健康的一個參考標準。而其本身又受到多種因子的調控[12].目前已經發現了許多肽可作為疾病診斷的標志物。 Bery等[13]在卵巢癌患者的腹腔積水中發現了777個差異表達的多肽,而其中的12條可能是卵巢癌潛在的腫瘤標志物。 Zhang等[14]發現了一個新的方法來辨別早期乳腺癌可變剪切的標志物亞型。 Tian[15]檢測了人HBV感染的多肽表達譜,識別了可能影響疾病進展的特異性血清肽。
4多肽在心血管疾病研究中的進展 心臟功能的順利執行主要依賴于精確的調控網絡,病理生理反應以及環境適應能力。心臟的獨特性不僅體現為其復雜的生物學發育過程,體系結構和不間斷收縮的特性,而且還體現在它具有能夠及時地對不斷變化的生理和神經心理情況做出反應的能力[16].因此,調節心臟發育和適應能力的調控網絡,一直都在被深入的研究探索[17].
心血管疾病在全世界范圍內仍然是發病率最高的疾病,所以挖掘新的診療工具對疾病的診斷及治療有重要的意義。多肽組學在心血管疾病中的研究主要有兩方面,一是發現在疾病病理生理過程中具有功能的肽,作為治療的藥物進行研究。二是尋找那些對疾病狀態作出反應的肽,這些肽可能作為疾病的診斷標志物。
4.1高血壓 回顧近幾年文獻,心房鈉尿肽(ANP)和腦鈉肽 (BNP) 都 參 與 了 血 壓 和 體 液 穩 態 的 調節[18],在新生兒體液循環中ANP的水平要明顯高于成人,而新生兒心室中ANP和BNP的水平都要高于成人,這可能是由于新生兒的心室較成人有著更強的ANP儲存能力[3].腦鈉肽(BNP) 是一種主要由心肌細胞產生的,具有利尿、利鈉和血管舒張功能的心臟利鈉激素。心房利鈉肽(ANP) 的作用是減少循環系統中的水鈉負荷,從而降低血壓[19]. ANP和BNP主要都在心臟組織合成:ANP來自心房、BNP來自心室[20],一些小鼠模型已經闡明了這些鈉尿肽的作用[21],這些數據均顯示鈉尿肽對于心臟發育的特定通路有著重要的作用。
鈉尿肽信號通路的復雜性通過另外兩個受體NPR2和NPR3與相應的活性肽的相互作用得到了進一步的闡明。 NPR2在心臟發育中的作用還未完全闡明,但是在大鼠上過表達NPR2的一個亞型受體可以造成心臟的肥大。在小鼠上敲除NPR3可以導致高血壓和骨骼肌的損害[22].
4.2先天性心臟病Eindhoven等[23]在研究成人先天性心臟病N-末端腦鈉肽原(NT-pro BNP) 水平與其心室功能關系時發現,NT-pro BNP水平在各種先天性心臟之間的表達有所不同。法洛四聯癥患者,升高的NT-pro BNP水平通常與左心室功能減退有關。大動脈轉位的患者,NT-pro BNP水平與右心室容積和右心室收縮功能相關。
Chen等[24]發現了一條由高度保守的基因所編碼的肽,這條肽對于斑馬魚的心臟發育較為重要。ELABELA,之前一直被認為是非編碼RNA,然而,作者發現ELABELA含有一段保守的ORF可以編碼54個氨基酸的蛋白。 ELA成熟體僅由32個氨基酸構成。研究人員變異了一些等位基因以此證明ELA可以導致心臟形態的異常。 ELA變異的表型類似于APLNR受體變異,而且ELA和APLNR均在原腸胚期前表達[25]. ELA在人胚胎干細胞和成人前列腺及腎臟組織中均有表達,研究人員認為ELA對成人心臟可能會有保護作用。