摘 要 目的 探討內皮細胞特異性分子 -1（ endothelial cell - specific molecule 1,ESM -1） 預處理小鼠骨髓間充質干細胞（ bone marrow - derived mesenchymal stem cells,MSCs） 后改善其生物學特性的機制。方法 通過不同濃度的 ESM -1,對 MSCs 進行預處理，分析其分泌的細胞凋亡相關因子包括腫瘤壞死因子 - α（ TNF - α） 、腫瘤壞死因子 - β（ TNF - β） 和干細胞生長相關因子： 缺氧誘導因子（ HIF） 、轉化生長因子（ TGF - β1） 等細胞因子含量的改變情況，以明確 ESM -1 預處理 MSCs 改善其生物學特性的機制。結果 通過不同濃度的 ESM -1 干預 MSCs 后，各濃度組 TNF - α、TNF - β、HIF、TGF - β1 含量隨著 ESM -1 干預濃度的升高而升高，各組之間差異有統計學意義（ P =0. 000） .結論 ESM -1 預處理 MSCs 可提高與炎性反應、細胞凋亡和細胞生長分化相關的多種細胞因子的含量，可能通過多種信號轉導通路改善 MSCs 的生物學特性。
關鍵詞 內皮細胞特異性分子 -1 骨髓間充質干細胞 小鼠。
Abstract Objective To explore the possible mechanism about improving the biological characteristics of endothelial cell - specificmolecule 1（ ESM - 1） pretreated with mice MSCs. Methods MSCs was pretreated by different concentration of ESM - 1. The possiblemechanism was analyzed about improving the biological characteristics of mice MSCs pretreated with ESM - 1 through analysis of its secre-ted cytokines content. The cytokines include apoptosis related factors: TNF - α and TNF - β； stem cell growth factor related: HIF andTGF - β1. Results After the intervention of MSCs with different concentration of ESM - 1,the content of cytokines levels includingTNF - α，TNF - β，HIF and TGF - β1 increased with the increase of the intervention concentration of ESM - 1. The difference between thegroups was statistically significant（ P = 0. 000） . Conclusion ESM - 1 pretreatment with MSCs can improve the content of many cytokinesrelated to inflammatory response,cell apoptosis,cell growth and differentiation,which may improve the biological characteristics of MSCsthrough a variety of signal transduction pathways.
Key words Endothelial cell - specific molecule 1; Bone marrow - derived mesenchymal stem cells; Mice.
ESM - 1 是具有多種生物學活性的細胞因子。本課題組前期研究證實，ESM - 1 預處理 MSCs 后可提高其存活、增殖能力，增加干細胞移植后的梗死周圍心肌組織血管形成[1,2].目前 ESM - 1 改善 MSCs生物學特性的具體機制尚不明確。因此，本實驗對其可能機制進行探討。
材料與方法。
1. 材料： 健康 SD 小鼠； CD29、CD44 抗體（ 北京夏斯生物科技有限公司，prospec cat: SV30010） ; ESM -1 （ Cusabio Biotech 公 司 ） ; TNF - α （ USCN,SEA133Mu） 、TNF - β （ USCN,SEA134Mu） 、TGF - β1（ USCN,SEA124Mu） 、HIF - 1α（ USCN,SEA798Mu） .器械： CO2培養箱（ 上海博訊公司，cat: BC - J160S） ;流式細胞儀（ BD C6） ; 倒置相差顯微鏡（ 日本 Nikoneclipse Ts100） ; 數字顯示隔水式電熱恒溫培養箱（ 上海躍進醫療器械廠） .
2. MSCs 獲取、培養： 取 2 月齡 SD 小鼠，沖出股骨骨髓成單細胞懸液，以 1000r/min 離心 5min.棄上清，用含 100ml/L FBS 的 DMEM 培養基重懸稀釋，以（ 1 ~ 5） × 109個/L 的密度接種、培養（ 37℃、50ml/LCO2、飽和濕度） .待細胞 90%匯合時傳代，傳代至第3 代時的 MSCs 用于實驗。
3. MSCs 標志鑒定： 細胞融合達 90% 時，用 2. 5g /L 胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，經 100 目的濾篩過濾，2000r/min 離心 5min.棄上清，用 PBS 制成 2 ×105/ L 的細胞懸液用于實驗。細胞懸液分裝在 2 支樣品管中，分別加入 Anti - mouse CD29、Anti - CD44- FIT; 37℃ 條件下，與細胞懸液反應 20min.加入PBS 1ml 混勻，2000r / min 離心 10min,棄上清。每管再加入 PBS 0. 5ml 制成細胞懸液，經流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD29、CD44 的表達情況。
4. 實驗分組： 將 MSCs 接種至 12 孔板，用含有10% FBS 的 DMEM 培養基培養，當細胞培養至覆蓋培養基單層時，用 0. 01mol/L PBS 浸洗 2 次，加無血清培養基 1 毫升/孔，形成初級培養液。將 MSCs 隨機分為兩組，分別接受以下處理： （ 1） 空白對照組： 不進行預處理。（ 2） 觀察組： 用 ESM - 預處理，根據ESM - 1 干預濃度，分為 10 個亞組： （ A 0. 2μg / ml、B0. 25μg / ml、C 0. 3μg / ml、D 0. 35μg / ml、E 0. 4μg / ml、F 0. 45μg / ml、G 0. 5μg / ml、H 0. 55μg / ml、I 0. 6μg /ml、J 0. 65μg / ml） ; 每組設 4 個復孔，每孔均處理60min.收集每孔的培養液，檢測預處理對 MSCs 分泌細胞因子的影響。
5. 細胞形態學觀察： 熒光倒置顯微鏡下細胞形態觀察，明確生長、分化情況。
6. 細胞因子 ELISA 檢測： 采用 USCN 公司試劑盒，定量培養液中各細胞因子的含量，按照試劑盒說明的操作進行。檢測的細胞因子包括 TNF - α、TNF - β、HIF、TGF - β1.
7. 統計學方法： 數據應用 SPSS 19. 0 統計學軟件處理。計量資料采用均數 ± 標準差（ x ± s） 表示。兩組間比較采用成組設計的 t 檢驗，3 組以上比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 q 檢驗，以 P < 0. 05為差異具有統計學意義。
結 果。
1. MSCs 標志抗原鑒定： 實驗結果顯示超過 90%小鼠骨髓間充質干細胞性表達 CD29 （ 細胞整合素分子） 和 CD44（ 黏附分子） ,證實為干細胞（ 圖 1） .
關鍵詞 內皮細胞特異性分子 -1 骨髓間充質干細胞 小鼠。
Abstract Objective To explore the possible mechanism about improving the biological characteristics of endothelial cell - specificmolecule 1（ ESM - 1） pretreated with mice MSCs. Methods MSCs was pretreated by different concentration of ESM - 1. The possiblemechanism was analyzed about improving the biological characteristics of mice MSCs pretreated with ESM - 1 through analysis of its secre-ted cytokines content. The cytokines include apoptosis related factors: TNF - α and TNF - β； stem cell growth factor related: HIF andTGF - β1. Results After the intervention of MSCs with different concentration of ESM - 1,the content of cytokines levels includingTNF - α，TNF - β，HIF and TGF - β1 increased with the increase of the intervention concentration of ESM - 1. The difference between thegroups was statistically significant（ P = 0. 000） . Conclusion ESM - 1 pretreatment with MSCs can improve the content of many cytokinesrelated to inflammatory response,cell apoptosis,cell growth and differentiation,which may improve the biological characteristics of MSCsthrough a variety of signal transduction pathways.
Key words Endothelial cell - specific molecule 1; Bone marrow - derived mesenchymal stem cells; Mice.
ESM - 1 是具有多種生物學活性的細胞因子。本課題組前期研究證實，ESM - 1 預處理 MSCs 后可提高其存活、增殖能力，增加干細胞移植后的梗死周圍心肌組織血管形成[1,2].目前 ESM - 1 改善 MSCs生物學特性的具體機制尚不明確。因此，本實驗對其可能機制進行探討。
材料與方法。
1. 材料： 健康 SD 小鼠； CD29、CD44 抗體（ 北京夏斯生物科技有限公司，prospec cat: SV30010） ; ESM -1 （ Cusabio Biotech 公 司 ） ; TNF - α （ USCN,SEA133Mu） 、TNF - β （ USCN,SEA134Mu） 、TGF - β1（ USCN,SEA124Mu） 、HIF - 1α（ USCN,SEA798Mu） .器械： CO2培養箱（ 上海博訊公司，cat: BC - J160S） ;流式細胞儀（ BD C6） ; 倒置相差顯微鏡（ 日本 Nikoneclipse Ts100） ; 數字顯示隔水式電熱恒溫培養箱（ 上海躍進醫療器械廠） .
2. MSCs 獲取、培養： 取 2 月齡 SD 小鼠，沖出股骨骨髓成單細胞懸液，以 1000r/min 離心 5min.棄上清，用含 100ml/L FBS 的 DMEM 培養基重懸稀釋，以（ 1 ~ 5） × 109個/L 的密度接種、培養（ 37℃、50ml/LCO2、飽和濕度） .待細胞 90%匯合時傳代，傳代至第3 代時的 MSCs 用于實驗。
3. MSCs 標志鑒定： 細胞融合達 90% 時，用 2. 5g /L 胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，經 100 目的濾篩過濾，2000r/min 離心 5min.棄上清，用 PBS 制成 2 ×105/ L 的細胞懸液用于實驗。細胞懸液分裝在 2 支樣品管中，分別加入 Anti - mouse CD29、Anti - CD44- FIT; 37℃ 條件下，與細胞懸液反應 20min.加入PBS 1ml 混勻，2000r / min 離心 10min,棄上清。每管再加入 PBS 0. 5ml 制成細胞懸液，經流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD29、CD44 的表達情況。
4. 實驗分組： 將 MSCs 接種至 12 孔板，用含有10% FBS 的 DMEM 培養基培養，當細胞培養至覆蓋培養基單層時，用 0. 01mol/L PBS 浸洗 2 次，加無血清培養基 1 毫升/孔，形成初級培養液。將 MSCs 隨機分為兩組，分別接受以下處理： （ 1） 空白對照組： 不進行預處理。（ 2） 觀察組： 用 ESM - 預處理，根據ESM - 1 干預濃度，分為 10 個亞組： （ A 0. 2μg / ml、B0. 25μg / ml、C 0. 3μg / ml、D 0. 35μg / ml、E 0. 4μg / ml、F 0. 45μg / ml、G 0. 5μg / ml、H 0. 55μg / ml、I 0. 6μg /ml、J 0. 65μg / ml） ; 每組設 4 個復孔，每孔均處理60min.收集每孔的培養液，檢測預處理對 MSCs 分泌細胞因子的影響。
5. 細胞形態學觀察： 熒光倒置顯微鏡下細胞形態觀察，明確生長、分化情況。
6. 細胞因子 ELISA 檢測： 采用 USCN 公司試劑盒，定量培養液中各細胞因子的含量，按照試劑盒說明的操作進行。檢測的細胞因子包括 TNF - α、TNF - β、HIF、TGF - β1.
7. 統計學方法： 數據應用 SPSS 19. 0 統計學軟件處理。計量資料采用均數 ± 標準差（ x ± s） 表示。兩組間比較采用成組設計的 t 檢驗，3 組以上比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 q 檢驗，以 P < 0. 05為差異具有統計學意義。
結 果。
1. MSCs 標志抗原鑒定： 實驗結果顯示超過 90%小鼠骨髓間充質干細胞性表達 CD29 （ 細胞整合素分子） 和 CD44（ 黏附分子） ,證實為干細胞（ 圖 1） .
