1 引言
DNA 納米結構由于精確可控的幾何外形而在眾多領域有著潛在應用[1]. 與無機納米材料相比, DNA納米結構的合成遵循 Watson-Crick 堿基互補配對原則, “自下而上”制備, 具有很多獨特的性質: 尺寸和形狀精確可控、化學反應活性、空間可尋址性等. 迄今為止, 研究者們已經成功制備了大小形狀可調節、機械性能各異、表面修飾多樣的二維和三維 DNA 納米結構[2~5], 并實現了 DNA 納米結構與其他材料的共組裝[6~11]. DNA 四面體[12]是最常見的一種 DNA 納米結構, 結構簡單\\(4~6 條 ssDNA 組成\\)、易大量制備、尺寸大小可通過棱長調節, 而且具有多個可修飾位點, 在生物傳感器領域中得到應用并表現出了很好的效果[13]. 此外, DNA 四面體還可以用作載體把蛋白質[6,7]或其他分子運送到細胞或者活體內部[14,15].
近年來, DNA 四面體穿過細胞膜的方式及其在胞內運輸的途徑等研究也有了突破性的進展[16]. 然而, 由于 DNA 錯誤折疊等現象存在, 獲得高純度、高產率的DNA納米結構依然是一個挑戰, 成為DNA納米技術應用的瓶頸問題. 因此, 發展簡單、高效的純化方法也成為人們關注的熱點.
目前, DNA 納米結構純化最常用的方法是凝膠電泳, 包括聚丙烯酰胺凝膠電泳\\(PAGE\\)和瓊脂糖凝膠電泳. 盡管電泳方法分辨率很高, 但是存在一些問題, 如回收率偏低、規模小、費時繁瑣且存在 DNA嵌入染料或者凝膠殘余等的污染. 最近 Shih 課題組[17]
首次報道了使用甘油速率區帶離心法純化一系列較大的三維 DNA 折紙納米結構的方法. 這種方法主要是利用單體與其各種副產物如聚集體以及原料如訂書釘鏈\\(staple 鏈\\)的沉降系數的不同而進行分離,其分辨率較低, 對于沉降性質差別較小的結構分離能力較差, 且對于較小的 DNA 納米結構也無能為力.因此建立一個高分辨率、快速簡便、可大規模純化的方法對于 DNA 納米結構的應用非常重要. 本文提出將傳統的高效液相色譜\\(HPLC\\)用于DNA納米結構的分離純化的方法.HPLC 是一種經典的分離技術, 分辨率高、可以高通量回收、可自動化, 廣泛應用于分析化學領域和生化領域. 最近 HPLC 在納米材料領域也有較多應用,已用來純化量子點[18]和金納米粒子[19]等. 陰離子交換色譜\\(AEC\\)非常適合于 DNA 的分離純化, 可用來分離各種 DNA 結構, 包括短的單鏈 DNA 和雙鏈DNA, 長的 PCR 產物和質粒 DNA 等. 它的分離原理是在陰離子交換樹脂\\(固定相\\)上含有兩種基團: 固定不動的陽離子基團和可交換的陰離子基團, 待測陰離子可與陽離子基團結合, 但這種結合是可逆的, 可被流動相中的陰離子交換, 當流動相陰離子濃度增加到足夠強度時, 待測陰離子便會被完全交換下來,從而達到分離純化的目的. DNA 是一類多陰離子的聚合物, DNA 結構越大, 陰離子越多, 與固定相親和性越高, 這種結構差異導致的性質差異可以被 HPLC有效區分.
本文擬用 AEC 方法分離 5 種 DNA 四面體, 棱長分別為 13 \\(實驗室自主設計\\)、17[12]、20[20]、26[10]和 30 bp[15], 依次命名為 TH13、TH17、TH20、TH26和 TH30; 此外, 還制備了 20 bp 棱長的三角雙錐[21],命名為 TB20, 考察 AEC 對 DNA 納米結構的分離效果.
2 實驗部分
2.1 試劑與儀器
三羥甲基氨基甲烷\\(Tris base\\)購自 Aladdin\\(中國\\), 純度99.9%; NaClO4H2O 購自 Sigma-Aldrich 公司\\(美國\\), 純化等級為 HPLC 級, 純度99.0%;GelRed DNA 染料購自 Biotium 公司\\(美國\\); 其他試劑均從國藥集團化學試劑公司\\(中國\\)購買. 整個實驗所用的水為 Milli Q 水, 18 MW cm. MWCO 30 kDa 濾管購自 Millipore 公司\\(美國\\); 陰離子交換色譜柱購自Thermo Scientific 公司 \\( 美國 \\), 型號為 DNAPacTMPA-100 BioLCTM Analytical 4×250 mm; DNA 寡核苷酸購自 Invitrogen 公司\\(美國\\), PAGE 純化, DNA 序列見表 S1 \\(網絡版補充材料\\).紫外-可見分光光度計\\(Hitachi U-3010, 日本\\);PCR 儀\\(applied Biosystems Veriti 96 well ThermalCycler, 美國\\); HPLC 系統: Waters 1525 泵\\(美國\\)、Waters 2998 光電二極管陣列檢測器\\(美國\\); 核酸蛋白質微量定量儀\\(IMPLEN NanoPhotometer P330, 德國\\); 化學發光成像系統\\(Syngene G:Box Chemi-XL,英國\\).
2.2 實驗方法
2.2.1 DNA 四面體及三角雙錐的自組裝
DNA 四面體通過一步退火來合成, 將各組分單鏈\\(4~6 條\\), 在 TM 緩沖液\\(0.01 mol/L Tris-HCl, 0.005mol/L MgCl2, pH 8.0\\)中等摩爾混勻, 通常 DNA 四面體各鏈終濃度為 1×10-6mol/L, 而 DNA 三角雙錐為1.7×10-7mol/L, 然后在 PCR 儀預設程序中退火, 預設程序一般為 95℃加熱 10 min, 迅速冷卻至 4℃, 在4℃停留 20 min 后取出樣品, 即完成組裝.
2.2.2 陰離子交換色譜\\(AEC\\)純化 DNA 四面體及三角雙錐
HPLC 所用流動相 A 為 0.025 mol/L Tris-HCl,0.375 mol/L NaClO4, pH 8.0; 流動相 B 為 0.025 mol/LTris-HCl, pH 8.0. 各個結構所用的洗脫方法見表 S2,DNA 四面體中 TH20 采用 AEC-1 程序, 其他采用AEC-2 程序進行分離, DNA 三角雙錐使用 AEC-3 程序進行分離, 260 nm 波長檢測并對產物進行收集.
