四氧化三鐵納米顆粒\\(IONPs\\)具有獨特的超順磁特性, 被廣泛應用在污水處理、分析檢測、生物大分子及細胞分離、藥物靶向運輸及可控釋放、腫瘤磁熱治療、磁共振成像等領域[1~5]. 2007年中國科學院生物物理研究所閻錫蘊教授課題組[6]發現IONPs能夠模擬辣根過氧化物酶\\(HRP\\)活性, 催化過氧化氫\\(H2O2\\)氧化底物\\(3,3,5,5-四甲基聯苯胺\\(TMB\\)、二氨基聯苯胺\\(DAB\\)、鄰苯二胺\\(OPD\\)\\)產生顏色變化. 其催化活性與HRP類似, 依賴于H2O2濃度、pH和反應溫度, 催化過程符合米氏動力學以及乒乓反應機制, 因此能夠替代HRP應用在酶聯免疫吸附分析\\(ELISA\\). 隨后, 針對IONPs催化活性的研究如雨后春筍般涌現, 涵蓋了包括環境保護、食品安全、生物醫學等多個領域[7~21].
1 特征及優化
表面未經修飾的IONPs催化TMB-H2O2反應具有以下特征: 最適反應條件為pH 3.5, 40℃; 低濃度H2O2促進酶樣活性, 高濃度H2O2抑制酶樣活性; 催化過程符合米氏動力學以及乒乓反應機制; IONPs催化活性源于納米顆粒表面的Fe2+; 顆粒越小, 比表面積越大, 單位質量納米顆粒催化活性位點越多, 催化活性更高; 表面修飾基團的包被厚度會影響IONPs與底物的相互作用[6].IONPs在較寬pH\\(1~12\\)或者溫度\\(4~90℃\\)的環境中孵育2 h后仍然保持良好的催化活性, 而HRP在pH低于5或者溫度高于40℃的環境中孵育2 h后完全喪失了催化活性[6]. 疊氮鈉是生物樣品防腐抑菌的重要添加劑. 0.02%疊氮鈉的存在抑制了HRP 99%催化活性, 而IONPs在該環境下能夠保持93%催化活性. 即使疊氮鈉濃度增加4倍, IONPs催化活性仍能維持在54%~82%水平[22]. IONPs催化活性對環境的強耐受性有望拓展其在分析領域特別是HRP使用受限環境中的應用.
過氧化物酶催化反應遵循米氏動力學, 米氏常數Km值大小表征酶與底物之間親和力的大小, Km值高則酶對底物的親和力低. IONPs具有類似HRP的催化功能, 但是其對底物H2O2的Km值卻遠高于HRP,表明其對H2O2的親和力較低[6], 催化反應需要較高濃度的H2O2. 提高IONPs對H2O2及其他底物的親和力, 可以增強IONPs的催化活性, 促進其過氧化物酶樣活性的應用. 通過對IONPs納米顆粒表面進行修飾, 改變表面電荷類型及大小, 有望增強IONPs與底物之間的靜電相互作用, 進而增強IONPs的催化活性.
喻發全等人[22]考察了表面電荷以及表面包被厚度等因素對IONPs酶樣活性的影響. 2,2-聯氮-二\\(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸\\)二銨鹽\\(ABTS\\)含有2個磺酸基,而TMB含有2個氨基. 由于靜電相互作用, 納米顆粒表面電荷會影響對這2種底物的親和力, 進而影響催化效率. 肝素修飾的IONPs表面負電荷最強, 催化TMB效率也最高; 聚乙烯亞胺修飾的IONPs表面正電荷最強, 催化ABTS效率也最高. 劉艷萍和喻發全[23]發現氨基修飾增強了IONPs對ABTS的親和力,而巰基修飾增強了IONPs對H2O2的親和力. 在IONPs表面共同修飾氨基與巰基, 將同時增強IONPs對ABTS和H2O2的親和力, 提高IONPs的催化活性, 有利于分析測定極微量H2O2以及其他能夠轉換為H2O2的物質. 卟啉能夠加速電子在IONPs和底物之間傳遞而促進底物氧化, 故卟啉功能化能夠增強IONPs過氧化物酶樣活性[24].
不同形狀的IONPs具有不同的比表面積和裸露晶面, 導致表面催化活性鐵原子的數量不同, 因而會導致不同的催化活性. Nath等人[25]制備了右旋糖酐修飾的IONPs, 其對底物TMB的親和力比未經修飾的IONPs強300倍. Liu等人[26]考察了不同形狀IONPs的過氧化物酶樣活性, 發現催化活性強弱順序依次為團簇>三角片>八面體.除IONPs外, 大量納米材料也具有過氧化物酶樣活性, 將這些材料與IONPs組合制備復合材料, 可能會起到協同增強模擬酶活性的作用[27~31].
2 應用
IONPs過氧化物酶樣活性催化機理可能是: H2O2以及底物 \\(如 TMB, ABTS等 \\)吸附在 IONPs表面 ;IONPs 表面的 Fe2+/Fe3+催化H2O2分解為羥自由基;IONPs通過部分電子交換作用穩定羥自由基; 羥自由基氧化底物發生顏色變化, 生成熒光產物, 或者化學發光等[12,24,32,33]. 充分利用催化機理及反應條件的可調節性, IONPs在環境保護、食品安全、生物研究、臨床 診 斷 治 療 等 領 域 具 有 廣 泛 應 用 , 如 免 疫 測定[6,10,27,34~40]、分析物濃度檢測[8,11,13~19,21~24,28,29,31,41~50]、清除污染物[7,9,12,30,32,33,51~56]、抑制細菌[57,58]以及腫瘤治療[57]等.
2.1 免疫檢測中作為HRP的替代物
HRP能夠催化顯色反應, 表面的賴氨酸殘基可以與多種分子進行交聯, 因此被廣泛應用于免疫化學領域如蛋白質免疫印跡\\(western blot\\)、ELISA、免疫組化\\(IHC\\)等. 然而HRP的應用存在一定限制, 如長期儲存容易失活, HRP-分子交聯物的生產和純化費用較高等. IONPs具有過氧化物酶活性, 且和天然HRP相比具有以下優點: 生產方法簡便, 成本低廉,對惡劣環境抵抗力強易于保存, 具有磁性, 容易回收重復使用以及單分子催化活性更高等. 因此, IONPs可以作為HRP的替代物應用在免疫化學領域, 有望降低分析成本, 提高分析系統穩定性.
