低劑量率輻照會產生兩種效應：低劑量刺激效應和輻射損傷效應。極低劑量率為正效應，可誘導農作物性狀改良[1]和品種改良、臨床上殺滅癌細胞的同時保護機體細胞。輻射損傷為負效應，可導致DNA雙鏈和單鏈斷裂[2],紅細胞及膜損傷[3],胸腺細胞凋亡[4]和癌細胞自我修復增強以及航空、軍事和工業元器件[5-6]的應用性能下降。明膠輻照滅菌已沿用傳統工藝多年，應用發現，輻照后明膠出現黏度下降的現象。當明膠的初始帶菌量高、初始黏度低時，輻照后的明膠細菌含量符合要求，但黏度大幅下降，由此降低或失去應用價值（GB 6783-94要求：明膠勃氏黏度大于1.8mPa·s,凝凍強度大于100g）[7].但這種現象在同等劑量加速器輻照或裝源量大的鈷源輻照時可避免。因此，研究低劑量率損傷效應具有重要意義。
水、蛋白質和氧氣輻照分解產生OH·、H·、e-aq、HO2·、O-2、RCH·CO-2、NH+3C·（R）CO-2等自由基[8],這些自由基間、自由基與分子間、分子內、分子間會發生多級反應，引起明膠分子的交聯、斷裂及其他變化[9].由于自由基含有未成對電子，具有自旋角動量，能產生磁性和自旋磁矩[10],常用電子自旋共振（ESR）譜儀檢測其信號強度和自由基濃度[11-13].ESR技術主要應用于木荷、絲綢[14]、聚丙烯腈纖維[15]、化學反應研究[16]等領域，用于研究劑量率輻射損傷效應的報道較少。
本文采用ESR等技術，檢測明膠經不同劑量率鈷源和加速器輻照后，自由基含量及結構的特性變化，探討劑量率對明膠輻射損傷的效應，為建立高劑量鈷源（或加速器）輻照明膠滅菌工藝提供參考。
1材料與方法
1.1主要試劑與儀器
明膠：CP級，國藥集團化學有限公司。
鈷源1:放射性活度1.22×1016Bq（33萬Ci），湖北省輻照實驗中心；鈷源2:放射性活度9.36×1016Bq（253萬Ci），深圳市金鵬源輻照技術有限公司；加速器：10MeV、15kW,深圳戈瑞輻照科技有限公司；JES-FA200電子順磁共振波譜儀：日本電子株式會社；凝膠滲透色譜：1515型高效液相色譜泵、2690D型分離模塊、2410型折射率檢測器、Waters ultrahy dro-gel 2000型和Waters ultrahy drogel 250型色譜柱，美國Waters公司；Quanta 200型掃描電鏡：荷蘭FEI公司；TA-XTPlus型質構儀：英國SMS公司；50mL稀釋型烏氏黏度計；電子萬能材料試驗機：深圳市瑞格爾儀器有限公司。
1.2輻照處理及劑量監測結果
將明膠在50℃下鼓風干燥至恒重后，進行定量有氧包裝。包裝后的明膠分別用鈷源1（劑量率約為60Gy/min）、鈷源2（劑量率約為480Gy/min）和加速器（劑量率約為1 200Gy/min）輻照，以硫酸亞鐵劑量計跟蹤吸收劑量。加速器工作條件：功率14.97kW、掃描電流7A、速度2.4~3.0m/min、載高3cm、加速電壓122kV.鈷源1輻照樣品的吸收劑量分別為4.5、8.7、13.0、17.3、27.3、36.6kGy,鈷源2輻照樣品的吸收劑量分別為8.8、20.2kGy,加速器輻照樣品的吸收劑量分別為8.0、30.6kGy.
1.3 ESR工作條件
初始場的磁感應強度為313.894mT,中心磁場的磁感應強度為323.894mT,磁場掃描寬度為20mT,掃描時間為60s,微波頻率為9 052.252MHz,微波功率為0.998 000mW,測量溫度為室溫。
1.4指標測定
相對分子質量大小及分布寬度：以0.1mol/mL Na2HPO4（pH=8.0）為儲備液，0.025mol/mLNa2HPO4（pH=8.0）為淋洗液，H2O-0.2mol/mLNaNO3為溶劑，進樣量為100μL,淋洗液流速為0.6mL/min.標樣為聚乙烯乙二醇，柱子溫度為40℃,檢測器溫度為40℃。
特性黏度：記錄在37℃恒溫下，一定體積、不同濃度（初始濃度c0及將初始濃度按體積比稀釋為2/3、1/2、1/3和1/4濃度）下明膠水溶液流經烏氏黏度計毛細管的時間。根據溶液流出時間t和蒸餾水流出時間t0,依次計算相對黏度ηr（ηr=t/t0）和增比黏度ηsp（ηsp=ηr-1）.以濃度c為橫坐標、ηsp/c和lnηr/c為縱坐標作圖，兩條曲線與縱軸的截距記為H1和H2,其平均值為H,H/c0即為特性黏度[η].
凝膠強度：按美國試驗標準GMIA采用質構儀測定。
斷裂伸長率：采用膜的拉伸模式試驗標準GB 1040-92進行斷裂伸長率的測定。測試條件：定伸長率20%、標距25mm、試驗速度100mm/min、定應力0.1mPa、試驗面積1.56mm2,測試時輸入膜厚度參數（以mm為單位），斷裂伸長率由計算機直接給出。
表面形貌分析：10%的明膠水溶液在低溫下形成凝膠后，在-80℃冰箱內速凍，再凍干，取少量凍干樣品，真空噴金后，采用掃描電鏡對樣品的表面和截面掃描。
2結果與討論
2.1輻照明膠的ESR譜特征
吸收劑量約8kGy的明膠經鈷源1、鈷源2和12 000Gy/min加速器輻照后，用ESR譜儀研究不同劑量率γ射線和電子束照射后明膠自由基信號的變化，結果示于圖1.圖1a顯示，未輻照明膠的自由基信號很弱，且噪聲較大。圖1b顯示，鈷源1和鈷源2輻照明膠后，自由基信號強度相近，加速器輻照后自由基信號強度最低，三者均表現出典型的特征雙吸收峰，幾乎重疊。
鈷源1、鈷源2和加速器輻照后吸收劑量分別為36.6、20.2和30.6kGy的樣品的ESR譜如圖2所示。與8kGy低劑量輻照明膠的ESR譜（圖1）相比，隨著劑量的增加，三種劑量輻照明膠的峰形無明顯變化。吸收劑量較接近的鈷源1（36.6kGy）和加速器（30.6kGy）輻照明膠的峰形高且窄，吸收劑量僅為20.2kGy的鈷源2輻照明膠的峰形矮且寬。
根據分裂因子計算公式g=0.071 45γ/H（H為共振場的磁感應強度，γ為微波頻率，取9 052.252MHz）和圖2計算g值和ΔH（峰與峰對應磁場的間距），結果列于表1.由表1可見，鈷源1的特征峰參數與加速器的較接近，鈷源2的g值略偏大，ΔH偏小，但差值不大?？梢?，輻照劑量率并未改變樣品的自由基性質，ESR譜峰形相似，未輻照明膠幾乎無響應信號。低劑量階段（圖1），高劑量率的低自由基信號強度效應較明顯，自由基信號強度由小到大依次為加速器、鈷源2、鈷源1.
電磁波或電子束在明膠蛋白質晶格內會產生輻射缺損，誘導長壽命自由基產生，當與周圍外加磁場相互作用時，會發生自旋共振吸收。鈷源和加速器產生的電子自旋和外加磁場間的相互作用不同，因此形成的譜線線形也略有差異[8,15].本研究發現，二者產生的自由基的特征峰相似，但強度有差異。
2.2劑量對自由基信號強度的影響
用鈷源1對明膠進行不同劑量輻照，研究吸收劑量與自由基信號強度的關系，結果如圖3所示。在0~36.6kGy吸收劑量范圍內，自由基信號強度（y）與劑量（x）呈現良好的相關性，擬合方程為：y=26.983x2+1 641.8x-205.69,R2=0.994 .當物質受到電離激發時，處于上下兩能級的電子發生受激躍遷，一部分低能級電子吸收電磁波能量躍遷到高能級，輻射誘發的順磁性物質產額與吸收劑量直接相關[18],因此，ESR反映的是一定條件下樣品吸收的總能量[19],能量吸收越多，共價鍵斷裂越多，從而自由基含量越高[20].本研究中吸收劑量與信號強度呈正相關，與文獻[21]報道的結果一致。
2.3劑量率對輻照明膠自由基信號強度的影響
用不同劑量率及輻照方式輻照明膠，其自由基信號強度示于圖4.由圖4可見，吸收劑量約為8kGy時，鈷源1、鈷源2和加速器輻照三種方式中，加速器輻照的明膠自由基信號強度最低，鈷源1和鈷源2輻照的明膠自由基信號強度相近；吸收劑量約為20kGy時，鈷源2輻照的明膠自由基信號強度低于鈷源1的；吸收劑量約為30kGy時，加速器輻照的明膠自由基信號強度低于鈷源1的?？梢?，相同劑量輻照時，自由基信號強度由高到低依次為：鈷源1、鈷源2、加速器。
加速器輻照產生的自由基信號強度低于γ射線的，可能是由于加速器電子束穿透能力有限，且作用時間短，單位時間自由基產生量大，使自由基瞬時濃度太高，難以及時擴散，自由基間發生反應而淬滅，造成自由基總量減少。在鈷源輻照中，大劑量率與小劑量率自由基信號強度產生差異與此推理相似，具體機理有待進一步分析研究。
2.4劑量率對輻照明膠平均相對分子質量的影響
吸收劑量約為8kGy時，不同劑量率輻照后，明膠流經凝膠滲透色譜（GPC）的信號響應值隨時間的變化示于圖5.由圖5可見，鈷源1輻照后明膠的保留時間最長，響應信號峰最矮；加速器輻照與鈷源2輻照后明膠的保留時間相近，但鈷源2峰較高。由GPC測定原理可知，相對分子質量越大，保留時間越短，峰越高?？梢?，相同吸收劑量下，鈷源2輻照明膠樣品平均相對分子質量最大，其次為加速器輻照的，鈷源1輻照的最小。
根據明膠GPC響應值與標準曲線對比，分析得到相對分子質量。鈷源1、鈷源2和加速器輻照明膠的相對數均分子質量（Mn）分別為2 810、3 875和3 358;相對重均分子質量（Mw）分別為4 389、7 119和5 973;多分散指數（Mw/Mn,用于衡量聚合物分子質量分布的寬度，該值越大，說明分子質量分布越寬，分子質量越不集中）分別為1.56、1.84和1.78.在35~40min之間出現小峰的原因是明膠大分子流出后，小分子保留在樹脂孔里，最后才被洗脫出來，倒峰為溶劑峰。由此可見，相同吸收劑量下，輻照明膠的Mn、Mw由大到小依次為：鈷源2、加速器和鈷源1.但分散指數以鈷源1最低，其次為加速器，鈷源2最高。
高分子受輻照后最重要的反應為輻照交聯與降解，同時性能發生顯著變化，包括分子質量增加或下降。在相對無水條件下，明膠屬于輻照降解型高分子，在輻照過程中分子質量逐漸減小。在降解過程中生成大分子自由基，空阻效應使大分子自由基較穩定，它們很難在分子鏈內遷移，也不易進行分子間的雙基復合反應，其主要反應趨勢是重排或歧化反應，主鏈斷裂后被穩定下來。這是明膠受γ射線輻照后，產生穩定性較好的自由基的機理。因此，穩定自由基含量可間接反應降解程度。
2.5劑量率對輻照明膠特性的影響
不同劑量率輻照后明膠的特性黏度、凝膠強度和斷裂伸長率列于表2.由表2可見，未輻照明膠的特性黏度為47.5mL/g,輻照明膠的特性黏度在41~42mL/g范圍內，且鈷源2和加速器輻照后明膠的特性黏度相近，鈷源1輻照后明膠的特性黏度略低。未輻照明膠的凝膠強度為642.8g,輻照明膠的凝膠強度在560~590g范圍內，凝膠強度的大小依序為：
鈷源2輻照后的明膠、加速器輻照的明膠和鈷源1輻照的明膠。未輻照明膠的斷裂伸長率為221.3%,輻照明膠的斷裂伸長率范圍為160%~200%,斷裂伸長率由大到小依序為鈷源2、加速器和鈷源1.
綜上所述，鈷源劑量率加大，有利于減少無水明膠蛋白的降解，保持較高的特性黏度、凝膠強度和明膠膜的斷裂伸長率。加速器輻照效果略次于鈷源2的輻照效果，但優于鈷源1的輻照效果。
有研究[3]表明，高劑量率輻照造成R·和ROO·的濃度相對較高時，自由基間的反應取代了自由基與完整分子間的反應，致使由·OH引發的鏈式反應蔓延過程受到限制，主要是鏈終止反應。相反在低劑量率時每個單位時間內幾乎均未形成脂質過氧自由基ROO·，而是與相鄰完整分子的反應導致鏈式反應被延長，故低劑量率對蛋白質產生更大程度的損傷。長壽命自由基對照后貯藏期明膠性能的影響有待進行深入、系統的研究。
2.6劑量率對輻照明膠微觀結構的影響
圖6為未輻照明膠和吸收劑量約8kGy的明膠表面放大500倍的掃描電鏡圖像。由圖6可見：未輻照明膠表面有少量凹陷，且有明顯未溶解的顆粒狀物；三種輻照方式下，明膠表面孔洞數量較未輻照明膠均有所增加，但隨著劑量率的增加，孔洞變淺，且逐漸模糊。鈷源1輻照明膠表面孔洞稀疏、大、深，基質表面光滑，鈷源2和加速器輻照的明膠表面孔洞逐漸變得不明顯，且凸起物密集，尤其是加速器。對于孔洞，推測是明膠凝膠在冷凍干燥過程中水分揮發形成的通道。對于突起物，分析是由于明膠溶解性差，在水溶液中分布不均造成的。明膠經不同劑量率輻照相同劑量后，分解反應程度不同，水溶解性不同，分解程度越大，溶解性越好，則凸起物越少，基質越光滑。由6圖還可見，劑量率越大，明膠輻照分解越少，表面突起越多。
3結論
1）未輻照明膠的ESR信號很弱，輻照明膠的ESR譜呈雙峰特征，峰高由高到低依次為：60Gy/min鈷源輻照的明膠、加速器輻照的明膠和480Gy/min鈷源輻照的明膠；2）明膠的平均相對分子質量、特性黏度、凝膠強度、斷裂伸長率由大到小依次為：480Gy/min112 000Gy/min加速器輻照的明膠、60Gy/min鈷源輻照的明膠；3）明膠的相對分子質量越小，水溶解性越好，SEM圖像表面越光滑，因此其表面粗糙程度由大到小的順序與平均相對分子質量的相同。4）自由基濃度越高，輻射化學反應越激烈，性能劣變程度越大。高劑量率產生低濃度長壽命自由基，有利于減小輻射損傷，其作用機理可能是：瞬時高濃度自由基間反應增加而帶來自由基的淬滅，減少了自由基對主鏈分子的攻擊機會。
具體機理有待進一步脈沖輻解研究加以佐證。
參考文獻：
[1] 章鐵，劉秀清，張金良，等.不同劑量率60Co-γ射線低劑量輻射對小麥農藝性狀的影響[J]．中國農學通報，2008,2（1）:220-223.
[2] 孔福全，王瀟，倪嵋楠，等.Li離子輻射致DNA損傷中的劑量率效應[M]∥中國原子能科學研究院年報.北京：原子能出版社，2007:144-145.
[3] 王俊玲，王衛東，徐志昆，等.不同劑量率的紫外線對紅細胞及其膜的影響[J].核農學報，2009,23（3）:526-529.
[4] 呂喆，劉淑春，劉揚，等.低劑量X線輻射誘導胸腺細胞凋亡及細胞周期進程適應性反應的劑量率效應[J].吉林大學學報：醫學版，2003,29（6）:719-722.
[5] 商懷超，劉紅俠，卓青青.低劑量率60Coγ射線輻照下SOI MOS器件的退化機理[J].物理學報，2012,61（24）:246010.
[6] 鄧偉，陸嫵，吳雪，等.雙極線性穩壓器（LM317）的電離總劑量效應及劑量率的影響[J].固體電子學研究與進展，2013,33（4）:398-404.
