原標題：無細胞的合成生物技術--多酶催化與生物合成

摘要 無細胞合成生物技術由于其高度可控及體外代謝途徑構建方法多樣， 能夠完成許多體內代謝途徑無法完成的工作。 其主體思想即體外多酶催化體系的構建， 通過模擬生物細胞內的多酶體系， 在體外反應系統中加入能進行順序反應的多種酶， 使底物經過順序的多步反應， 一次得到最終產物， 使生產過程大大簡化。 將多酶催化體系進行共固定化， 可以實現多酶體系的協同反應和底物通道效應， 提高反應效率。 未來幾年， 無細胞合成生物技術有望成為生物燃料、大宗化學品以及醫藥產品的低成本生物制造平臺。

關鍵詞：無細胞；多酶催化體系；共固定化；底物通道；合成生物技術

1 合成生物技術。

合成生物學是新出現的一門綜合了分子生物學、工程學、數學等許多研究內容的交叉學科， 它借鑒工程化的思想研究生命， 目的是通過人工設計和構建高效、可控的生物系統來解決能源、材料、健康和環保等問題[1]. Scientific American 的編輯 David Biello曾經用一個簡單的比喻來說明什么是合成生物技術：如果將生命比作電腦， 那么， 由許多核酸組成的程式碼-基因體， 就是生命的作業系統。 合成生物技術想做的就是， 透過創造或改寫基因組， 讓生命表現出預期的行為， 執行預定的工作。

合成生物技術一經興起， 便得到全世界的廣泛關注。 早期合成生物技術的研究內容主要為標準調控元件的設計與合成； 現階段的研究內容擴展為通過系統生物學指導， 理性組裝各種合成生物元件， 使其成為定向執行某種生物功能的代謝通路、系統或者一種全新的細胞[2]. 經過 10 余年的探索， 細胞體內代謝途徑的構建已經取得了相當大的進展， 其中的典型代表即為 Keasling 課題組[3,4]利用合成生物技術的方法在大腸桿菌和釀酒酵母中均成功構建的紫穗槐二烯（青蒿素前體物）的合成路徑， 建立了有效而價廉的青蒿素合成方法。 伴隨基因組學和系統生物學的不斷進步， 合成生物技術將會給產品開發帶來革命性的影響， 為世界帶來新一輪產業發展浪潮。 中國已經制訂了合成生物技術戰略路線圖， 規劃了技術、工業應用、醫學和農業等方面的中長期目標： 未來 5 年，爭取建立標準元件數據庫， 形成化學品和生物材料的模塊化設計和生產能力； 未來 10 年， 力爭形成生物系統設計、建模和驗證一體化平臺， 商業化生產眾多自然化合物、藥品、化學品和生物燃料。

但是， 在實際操作過程中， 并不是所有人工設計的代謝途徑都能在宿主細胞體內表現出預期的效果，原因主要有以下幾方面： 生物系統構建復雜難以預測； 許多人工合成的生物元件與宿主細胞的兼容性問題； 目標產物對宿主細胞的抑制； 生物系統的穩定性問題等[5]. 相比于調控活細胞的代謝， 體外多酶催化體系顯得更具靈活性及可操作性。

2 無細胞的合成生物技術-多酶催化體系。

無細胞的合成生物技術的核心思想為體外多酶催化體系的構建， 即模仿體內代謝途徑， 在體外組合一系列酶及輔酶， 構建復雜的生化代謝網絡以獲得目標產物的過程[6]. 無細胞的合成生物技術近年得到很大提升， 并不斷迅速發展。 這種快速的發展基于無細胞的合成生物技術平臺的幾個重要特點[7~9], 包括：

（1） 沒有宿主細胞的生理調控系統， 反應條件更容易控制， 可以方便地進行反應條件的優化； （2） 不存在副反應和宿主細胞本身的代謝需求， 能夠達到更高的產品得率和產品純度； （3） 可以使用高負載量的酶，用于提高反應速率； （4） 寬泛的反應條件（如高溫、有機相催化體系）、底物的自由選擇， 解決了底物或中間產物的毒性問題； （5） 具有相當大的工業化潛力。

無細胞的合成生物技術可以看作一個基于三要素的集成式平臺， 包括： 代謝途徑重新構建、酶工程和反應工程[10]. 代謝途徑重新構建需要以體內代謝途徑為基礎， 組裝相應的酶和輔酶。 與體內代謝途徑可以自動平衡輔酶和產生腺苷三磷酸（ATP）不同， 構建體外代謝途徑必須設計輔酶再生系統和 ATP 合成體系。 此外， 需要進行詳細的熱力學分析， 以確保設計的代謝途徑和預期相符。 酶工程經過近半個世紀的發展， 是一個相對成熟的研究領域， 涉及酶的發現、酶的大量制備、理性設計、定向進化和酶的固定化等。 反應工程包括生物反應器的設計（如膜反應器、流加反應器、連續攪拌釜式反應器）、多個反應的級聯、反應條件的優化等。

3 多酶催化體系的構建策略。

3.1 底物通道效應。

多酶催化體系反應過程中， 中間產物要經分離純化才能進行下一步產應。 中間產物在分離過程中損失較大， 產率相對較低。 對催化反應的多種酶進行理性設計， 在一定空間內實現級聯催化， 可有效減少反應步驟及反應設備的初始投入， 減少中間產物的擴散阻力、增加其局部濃度， 降低中間產物在分離過程中的損失， 提高最終產物的收率。

底物通道效應（substrate channeling）指在多酶催化的代謝途徑中前一個酶所催化產生的產物直接進入下一個酶的活性中心， 而不是擴散進入所在的反應體系環境中[11]. 在傳統的生物催化級聯過程中， 所有的酶均勻分布在反應器中， 存在酶穩定性差、產物分離復雜、酶難以回收、環境耐受性差以及中間傳遞效率等諸多問題， 因此， 需要發展有效的固定化酶策略來實現多酶催化的底物通道效應， 同時可以保持酶的活力穩定性及重復使用性。

多酶催化體系的固定化是酶工程領域的前沿課題之一， 探索和研究新的固定化技術， 開發適用范圍廣、可應用于多酶催化的固定化酶載體材料， 為多酶體系創造適宜的微環境是這一領域的基礎性研究。

當前多酶催化體系的固定化主要有以下方式： 簡單的多酶融合、使用支架系統進行共固定化、簡單的共固定化及位置組裝的共固定化等（圖 1）[12~16].多酶催化體系的固定化效果與載體的選擇有很大關系， 載體材料的結構和性質對固定化酶的活性有很大影響[17]. 隨著固定化技術的發展， 載體材料由最初的天然高分子材料， 擴展到合成高分子材料、無機材料及現在備受關注的復合材料。 復合載體材料綜合利用高分子材料和無機材料優點， 與其他載體材料相比， 具有特殊功能的復合材料有巨大優勢， 因此復合材料是固定化載體材料發展的必然趨勢[18,19].

基因工程領域的最新研究進展表明， 生物偶合可以提供相應的工具以更加可控的方式構建多酶催化體系， 通過人工合成的結合域， 可以將參與反應的多個酶共同固定于支架體系， 如 RNA 支架系統、DNA 支架系統、合成蛋白支架系統、自組裝蛋白支架體系等。 在利用 RNA 分子作為支架系統方面，Delebecque 等[20]利用 RNA 分子適配體將產氫需要的2 種酶進行了空間組裝， 利用 RNA 分子的折疊形成一維或者二維的腳手架結構從而實現酶分子的空間構建， 其中二維結構的 RNA 腳手架結構使氫的產量提高了 48 倍。 在利用 DNA 分子作為支架系統方面，Wilner 等[21]以 DNA 分子作為腳手架形成六角形結構，將葡萄糖氧化酶（GOX）和辣根過氧化物酶（HRP） 2 個酶進行固定化， 將酶分子聚集后反應速率大幅度提高。 在利用蛋白質作為支架體系方面， 不僅可以利用自然界存在的蛋白作為支架， 也可以人工構建新的蛋白支架體系。 細菌纖維小體是多種纖維素酶、半纖維素酶依靠錨定-黏附機制所形成的一種多酶體系，通過細胞黏附蛋白附著在細菌的細胞壁上。 近年來，通過模仿自然界中纖維小體的構造人工合成纖維小體得到了廣泛研究， Tan 課題組[22]利用來自 Clostri-dium cellulovorans, C. cellulolyticum, C. thermocellum的錨定結構域和黏附結構域構建了人工纖維小體，通過黏附-錨定機制將降解纖維素的酶固定到釀酒酵母細胞壁的表面， 將纖維素降解后在酵母體內進一步轉化生成生物乙醇。 利用這種方法， 乙醇的產量最高達到 1.4 g/L. 另外， 利用蛋白質的自組裝進行多酶體系的構建也具有廣闊的應用前景， 借助蛋白質的自組裝完成多酶體系的構建只需要將蛋白質或者酶分子進行簡單的混合而不需要進行特殊處理。 Dueber等[23]利用信號轉導過程相關蛋白的一部分作為蛋白支架體系構建腳手架， 3 個支架蛋白包括 GTP 酶結合結構域（GBD）、SH3結構域（SH3）和PDZ結構域（PDZ）。

通過將催化乙酰 CoA 到甲羥戊酸的 3 個酶-乙酰CoA 硫解酶（AtoB）、HMG-CoA 合成酶（HMGS）和HMG-CoA 還原酶（HMGR）分別與 GBD, SH3, PDZ 的配基相連， 利用配基與蛋白支架之間的特異性相互作用從而將 3 種酶分子組成多酶復合體， 通過進一步優化支架體系， 調節不同支架蛋白的比例， 甲羥戊酸的產量最高提高了 77 倍。

3.2 生物積塊（building blocks）與模塊（modules）的構建。

無細胞的合成生物技術采用自下而上的設計策略， 包括生物積塊的構建（單獨的酶）、幾種酶組合成的功能模塊的構建（產物生成模塊、輔酶再生模塊、ATP 合成模塊）和復雜代謝途徑的組裝及應用（以糖為底物生產氫氣等）。 體內代謝途徑的標準生物組件是對應的 DNA 序列， 體外代謝途徑的標準生物組件則是各種酶。 通過將多個酶組合成功能模塊， 再將不同的功能模塊進行組裝， 可以實現體外代謝途徑的構建。

酶催化的生物轉化反應中， 約30%是氧化還原反應， 這些反應需要輔酶/輔因子的參與， 如煙酰胺腺嘌呤二 核苷酸 /煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD（P）H）或黃素腺嘌呤二核甘酸（FAD）。 宿主細胞可以通過合成代謝和分解代謝的平衡來調節輔酶/輔因子的量， 體外多酶催化體系則需要不斷補充輔酶/輔因子。 在體外構建多酶催化體系， 底物的成本需要遠低于產物的價值， 因此， 通過組合積塊構建廉價的輔酶再生模塊顯得尤為重要[24].

NADPH 是最常見的輔酶， 其在體外的再生可以通過以單個酶催化底物供氫體或級聯多個酶來進行反應[25]. 單酶構建的 NADPH 再生模塊已被廣泛用于合成各種化合物。 3 種代表性的單酶構建的 NADPH再生模塊是醇/醇脫氫酶、甲酸/甲酸脫氫酶和葡萄糖/葡萄糖脫氫酶[26,27]. 以 1 個多酶催化體系中輔酶再生模塊的構建為例， 1 個由 12 個酶組成的體外多酶催化體系， 以纖維二糖為底物生成 1 個單位的葡萄糖可以產生 12 單位的 NADPH[28]. 在所有的供氫體化合物中， 成本最低的是糖類， 但以它們為底物構建輔酶再生模塊需要添加較多的酶， 增加了系統的復雜性。 利用電化學反應進行輔酶再生成本較低且相對清潔無污染， 但 NADPH 在高電位時穩定性很差， 如果想在工業上應用這項技術， 必須解決現存的問題。

ATP 是所有生物體的通用能量。 與宿主細胞內可以不斷合成 ATP 不同， 在體外多酶催化體系中，如果某些反應需要 ATP 參與， 需要設計 ATP 再生模塊， 低成本 ATP 再生是其面臨的一個最關鍵的障礙。

體外 ATP 再生的方法包括底物水平磷酸化、NADPH的氧化磷酸化和光誘導 ATP 合成[29,30].

目前應用最廣泛的體外 ATP 再生技術是底物水平磷酸化， 常見的磷?；w包括乙酰磷酸、磷酸二羥丙酮和磷酸肌酸等。 這些磷酸鹽的利用會導致磷酸根的積累， 從而改變 pH, 抑制體系中的酶活。 此外，過高的底物成本也導致其不能應用于大規模生產。

使用非磷酸鹽的化合物可避免磷酸根積累的問題。

通過利用糖酵解途徑中的反應， 葡萄糖和丙酮酸鹽已作為底物用于無細胞體系中 ATP 的合成。 最近，由麥芽糖糊精磷酸化酶介導的反應以麥芽糖糊精作為底物生成 ATP, 與葡萄糖相比， 每單位麥芽糖糊精可以多生成1個ATP, 同時生成可以緩慢釋放能量的化合物葡萄糖-6-磷酸， 更可能應用于大規模生產[31].

4 多酶催化體系的應用。

無細胞多酶催化體系的應用最初可以追溯到100 多年前。 1897 年， Eduard Buchner 使用酵母提取物將糖轉化成乙醇和二氧化碳， 憑借這一成就， 他獲得了 1907 年的諾貝爾化學獎。 從那時起， 無細胞多酶催化體系逐漸為人們所熟知并加以應用。 無細胞多酶催化體系的構建不僅能在一定程度上克服體內代謝途徑的缺點， 還擁有產量高、純度高以及反應速度快等優點， 目前已經成為合成高價值化合物和生物能源的一種新選擇[32].

4.1 生物制氫。

無細胞合成體系最初在生物產氫研究領域取得了較大的突破。 美國橡樹嶺國家實驗室的 Woodward等[33]利用葡萄糖-6-磷酸作為反應底物， 在體外成功構建了 1 條生物產氫的催化途徑， 最終每摩爾葡萄糖-6-磷酸經過一系列反應得到了 11.6 摩爾氫氣。 然而，葡萄糖-6-磷酸作為反應底物存在幾個缺點： 成本偏高； 游離的磷酸作為最終產物會結合 Mg2+, 從而影響參與反應的部分酶的活力； 磷酸積累造成 pH 波動過大， 不利于體系的平衡[34]. 弗吉尼亞理工大學的Zhang 課題組[31]為了解決這些問題， 將葡聚糖作為反應起始底物， 利用低聚的糖苷鍵和多糖的化學鍵能量， 通過添加少量可回收利用的磷酸根離子和適當的磷酸化酶， 在原有途徑基礎上引入了從葡聚糖到葡萄糖-6-磷酸的兩步反應， 取得顯著效果， 氫氣產量提高到 12 mol/mol（底物）， 且不需添加 ATP. 由于葡聚糖價格更低（約 0.15 $/kg）、更易獲得， 因此新途徑能有效降低生產成本（圖 2）。 2013 年， Zhang 課題組[35]在體外構建了利用木糖產氫氣的無細胞合成體系（圖 3）。 可以預見， 通過使用更為廉價的底物可以進一步降低成本， 為生物產氫工業化奠定基礎。

4.2 生物食品和生物燃料。

纖維素是地球上含量最豐富的有機化合物之一，并且是可再生能源的一種理想原材料來源。 如今， 它還能夠解決人類的溫飽問題。 在一項新的研究中，Zhang 課題組[36]找到了一種將纖維素轉化為淀粉的新途徑。 為了實現這種轉化， 他們選擇了植物、真菌和細菌來源的內切葡聚糖酶-纖維二糖水解酶、纖維二糖磷酸化酶和a-葡聚糖磷酸化酶， 通過基因設計與優化， 人工合成具有大腸桿菌密碼子偏好性的基因序列， 在大腸桿菌中表達， 最終得到了需要的酶，并在體外構建了多酶催化體系（圖 4）。 與將纖維素完全分解為葡萄糖， 再重新將其組裝為淀粉不同， 他們首先將纖維素分解為纖維二糖， 隨后將纖維二糖分解為葡萄糖及G-1-P, G-1-P起到構建直鏈淀粉模塊的作用。 通過這種體外多酶催化體系， 他們可將高達30%的纖維素轉化為淀粉， 剩下的纖維素水解為葡萄糖， 通過酵母的轉化在同一生物反應器中生產乙醇。

可以預見， 下一代的生物精煉廠將會使用這種體外多酶催化體系同時生產食品和生物燃料。

丁醇是一種高品質的汽油替代燃料， 與傳統的乙醇燃料相比有很大優勢： 能量密度高， 接近于汽油；親水性低， 能與汽油高比例混合； 可以使用現有石油管道進行運輸等。 此外， 丁醇還是一種重要的大宗化工產品， 每年全球市場需求達 50 萬噸左右。 近幾年來， 美國 UCLA 的 Liao 課題組[37]對異丁醇的生物制造進行了深入研究。 通過利用支鏈氨基酸的生物合成途徑和 Ehrlich 途徑， 在大腸桿菌等模式生物中構建了異丁醇的生物合成途徑， 可以把糖轉換為異丁醇。 但異丁醇的體內合成面臨諸多限制因素， 其中之一即為使用重組大腸桿菌生產異丁醇， 當產量達到1%~2% （v/v）時， 異丁醇即對宿主產生毒性作用， 從而降低了宿主的生長速率和產物收率。 TUM的 Sieber課題組[38]設計了一種體外的多酶催化體系可以將葡萄糖轉化為異丁醇或乙醇。 他們人工構建了最小化的糖酵解級聯反應， 反應只需要添加一種輔酶（圖 5略）。在耐受性試驗中， 無細胞的多酶催化體系在異丁醇產率高達 4% （v/v）時反應速率仍不受到影響。

4.3 生物制藥。

抗生素是由微生物或高等動植物所產生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物。 目前臨床常用的抗生素很多是由基因工程菌發酵得到， 在體外構建多酶催化體系生產抗生素， 可以避免基因工程菌在合成抗生素時產生的自我抑制情況， 具有很好的發展前景。 加州大學圣地亞哥分校的 Moore課題組[39]2007 年首次在體外構建了 II 型聚酮類化合物的合成途徑， 該體系利用苯甲酸及丙二酰 CoA 作為反應底物， 在外源補加ATP及NADPH的條件下得到了天然抗生素-腸球菌素（圖 6）。

除此之外， 無細胞多酶催化體系也已經應用于其他領域， 如精細化工合成[40]、生物閉合電路構建[41]、無細胞蛋白合成[42]和各種單糖或多聚糖合成[43].

5 總結。

無細胞合成生物技術由于其高度可控及構建體外代謝途徑的方法多樣， 正逐漸成為一個強大的技術平臺， 能夠完成許多體內代謝途徑無法完成的工作。 相對于傳統的微生物發酵生產， 無細胞多酶催化體系擁有諸多優勢， 但其未來的應用仍存在相當大的挑戰， 即其應用存在一定的局限性。 這種局限性表現在兩個方面： （1） 缺乏通用的積塊（酶或輔酶）， 使其成本偏高。 現代工業化生產最重要的就是標準化和規?；?， 只有通過基因工程手段構建大量熱穩定的、價格低廉的酶， 并發展仿生輔酶類似物， 才能大幅降低無細胞合成生物技術的成本， 使其可以與傳統的微生物發酵進行競爭； （2） 反應速率仍有待大幅提高。 可以通過優化多酶體系的催化模型、代謝流分析、增加底物濃度、增加酶裝載量、提高反應溫度等手段加快反應速率、提高催化效率。 對于無細胞的合成生物技術， 現階段的發展目標是在低成本和工業化大規模的基礎上構建可控的、高效的多酶催化體系。

可以充分挖掘無細胞系統的潛能， 實現更好的學習、控制和調節。 隨著酶制備成本的降低及酶工程技術的不斷提高， 相信在不遠的將來， 無細胞的合成生物技術將越來越多地應用于生物制造業。

參考文獻：