淀粉是由脫水葡萄糖單位構成的生物高聚物，大部分是以淀粉顆粒的形態存在，不論來自何種植物或組織，都包含2種主要的多糖，即直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉通常被定義為線性長鏈分子，是由脫水葡萄糖單位經過α-1，4糖苷鍵連接而成的，而支鏈淀粉是由葡萄糖經過α-1，4糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵連接而成，即由許多短鏈在還原端通過α-1，6糖苷鍵連接在一起，使支鏈淀粉具有高度的分支。由于直鏈淀粉和支鏈淀粉的結構不同，且在淀粉中的含量不同，所以決定各類淀粉的結構和性質的差異。
淀粉顆粒是一種半結晶的聚合物，其包含有結晶區和無定形區。淀粉顆粒中形成結晶區的主要為支鏈淀粉，支鏈淀粉分子相互聚集形成的雙螺旋結構是結晶的基礎。而直鏈淀粉是組成淀粉顆粒無定形區的主要成分。然而在高直鏈淀粉品種下，淀粉分子是如何影響淀粉顆粒的結構的，目前仍不是十分清楚。
這主要是由兩方面的原因造成的：一是缺乏更為有效的技術；二是淀粉降解模型的設計上需要更科學化。
雖然已有許多通過酶降解體系來研究淀粉結構，例如分析降解前后淀粉顆粒形態和分子結構的變化等，然而采用不同的方法和技術分析淀粉的結構仍顯得十分必要。本試驗采用復合微生物發酵的方法結合色譜檢測技術，試圖從不同的角度來研究淀粉的精細結構。
1 試驗材料和方法
1.1 試驗材料
普通玉米淀粉，購于Sigma公司（美國）；高直鏈玉米淀粉，來源于國民淀粉公司（澳大利亞）；其他試劑都為化學分析純度。
1.2 試驗方法
1.2.1 淀粉蒸煮
玉米淀粉的蒸煮處理：將淀粉與蒸餾水相混合制成水分含量為60%的淀粉乳，置于高壓鍋中于121℃處理30 min，冷卻后重復高壓處理兩次。取出后冷卻，冷凍干燥，將干燥后得到的固體經粉碎機粉碎后過0.5 mm的篩網。
1.2.2 微生物發酵處理
利用微生物發酵法降解普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉，對其降解前后的分子結構進行分析。具體的試驗過程為：利用磷酸緩沖液將來源于健康人體糞便制備成固形物10 g/mL的腸道微生物混合菌液，用于體系發酵。取200 mg淀粉樣品底物加入到含有9 mL發酵介質的發酵瓶中并水合1 h（溫度控制在4 ℃）。發酵介質包含以下物質（每1 L蒸餾水）：2.5 g胰蛋白酶、125 μL礦物質溶液（每1 L蒸餾水中132 g CaCl2·2H2O，100 g MnCl2·4H2O，10g CoCl2·6H2O，80 g FeCl3·6H2O）、250 mL緩沖溶液（每1 L蒸餾水中4 g \\(NH4\\)HCO3、35 g NaHCO3）、250 mL礦物質溶液（每1 L蒸餾水中5.7 g Na2HPO4，0.6g MgSO4·7H2O）和1.25 mL刃天青溶液0.1 g/mL。取33.5 mL滅菌后的還原性溶液（每1 L蒸餾水中6.25 g半胱氨酸鹽酸鹽，6.25 g Na2S·9H2O，40 mL NaOH）添加到1 L發酵介質中，發酵介質的pH調整到7.2。每個發酵瓶接種1 mL的微生物混合菌液，每毫升混合菌液中含有1×1010活菌，最終保證達到每個發酵瓶中含有1×109活菌。每個試驗瓶中用氮氣噴霧，并用石蠟密封作為防止泄露的預防措施。試驗瓶在37 ℃振蕩中培養24 h，發酵結束后立即冷凍貯藏。
1.2.3 利用HPLC分析2種淀粉的分子組成取不同發酵時間段的發酵液冷凍干燥，取固形物50 mg放入25 mL離心管中，向其中加入8 mL二甲亞砜（DMSO）和水的混合液（DMSO與H2O的體積比為90∶10）。每只離心管封蓋，置于沸水浴中加熱30min，冷卻后加入20 mL無水乙醇，封蓋后均勻震蕩3min，靜置5 min后于3 000 r/min條件下離心，棄去上清液，加入20 mL無水乙醇再次震蕩離心。再次用乙醇洗滌重復操作得淀粉沉淀物。
取15 mg該淀粉沉淀物，用0.5 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液溶解該淀粉，震蕩混合10 s。向所得溶液中加入0.5 mL 0.05 mol/L的乙酸鈉緩沖液（pH 4.0）進行中和，然后加入離子交換樹脂（0.20 g，BioRad AG?
501-X8，Hercules，USA），并于50 ℃水浴鍋中保持1.5h。于10 000 r/min 離心10 min后，得上清液，進行HPLC分析（LC 1150，GBC Instruments， Vic， 澳大利亞）。色譜柱為UltrahydrogelTM250柱和保護柱（7.8mm×300 mm，Waters，日本），檢測器為蒸發光散射檢測器（ELSD）（ALLTech，Deerfield， 美國）。流動相為0.05 mol/L的醋酸銨緩沖溶液（pH 5.2）。
1.2.4 掃描電子顯微鏡（SEM）觀測淀粉顆粒的形態。取不同發酵階段的發酵液，經冷凍干燥、粉碎后，均勻地撒在貼有雙面膠的樣品面盤上，用Hitachi1B-3離子涂布器噴金固定，然后利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察并記錄顆粒形態。發酵前的淀粉樣品直接用SEM觀察并與前者進行比較。每種淀粉樣品至少記錄3次顆粒形態。
2 結果與討論
2.1 淀粉分子的色譜圖
2.1.1 發酵前2種淀粉分子色譜圖的比較
對于普通玉米淀粉，其分子主要由2個組分組成，即大分子的支鏈淀粉和相對分子量較低的直鏈淀粉，其中支鏈淀粉占較大比例；而對于高直鏈玉米淀粉，液相色譜圖（圖1b）顯示其是由3個組分所組成，分別為大分子的支鏈淀粉、相對分子量較低的直鏈淀粉以及更低分子量的直鏈淀粉。為了便于理解，本試驗將直鏈淀粉的這兩個組分分別稱為高分子直鏈淀粉分子和低分子直鏈淀粉分子。這種分子結構是現階段本試驗研究的最新發現，特別是目前人們對于低分子直鏈淀粉的分離、結構測定等方面研究還不充分，對于該組分又是如何影響淀粉的結構和降解特征的研究也有待于更深一步進行。
2.1.2 原淀粉（未蒸煮）在發酵過程中淀粉分子色譜圖的變化
對于普通玉米淀粉而言，在發酵過程的前半段（即從0~12 h），直鏈淀粉和支鏈淀粉比例似乎變化不大。這可能說明微生物同時利用直鏈淀粉和支鏈淀粉2個組份，即同時利用淀粉顆粒的結晶區和無定形區。而隨著發酵過程的進一步進行，直鏈淀粉表現出較強的易降解性，這個結果可能提供兩個方面信息：
一是直鏈淀粉在淀粉顆粒中的分布狀況；二是隨著發酵的進行，微生物產生了大量的分解酶，酶對淀粉表面及內部侵蝕，這就為發酵的后半階段（12~24 h）微生物有效利用非結晶區提供了前提。這也就是為什么在發酵的前半段淀粉顆粒中支鏈淀粉和直鏈淀粉的比例變化不大，而在發酵的后半段直鏈淀粉則被快速地利用。
而對于高直鏈玉米淀粉的發酵，則呈現出極其特異的現象。從色譜圖（圖1b）所呈現出的變化來看，高直鏈淀粉分子在發酵的前半段就呈現出了極強的被利用狀況，相反低分子的直鏈淀粉則表現出了與支鏈淀粉相類似的低發酵特性。這一點為重新認識淀粉的結構特征特別是對新型淀粉品種提供了非常有用的信息。眾所周知直鏈淀粉是形成非結晶區的主要成分，其被降解酶快速有效的利用已經達成共識。而低分子直鏈淀粉的存在以及其對淀粉顆粒結構的影響可能使人們對淀粉的結構有重新認識，也就是說低分子直鏈淀粉在淀粉顆粒中的分布狀態、分子排列情況等性質都需要做深入的研究。
2.1.3 蒸煮后淀粉在發酵過程中淀粉分子色譜圖的變化
蒸煮過程不僅可以破壞淀粉顆粒表面的形貌，還破壞淀粉顆粒的內部結構，主要體現在兩個方面：一是淀粉內部的結晶區被破壞，支鏈淀粉的分枝雙螺旋的有序排列被打亂，在水溶液狀態中形成大分子的纏繞狀態；另一個變化是無定形區中直鏈淀粉的重排，直鏈淀粉在回升過程中形成更為有序的排布狀態，這種變化會在其被微生物的利用過程中體現出來。對于普通玉米淀粉，被打亂有序排列結構的支鏈淀粉表現出被快速利用的現象，圖譜（圖1c）顯示24 h發酵后基本上未檢測出支鏈淀粉分子，這說明大分子的支鏈淀粉即使發生了在回升過程中的分子重排，但仍快速地被微生物利用。其圖譜中所檢測出的小分子物質可能是由高分子直鏈淀粉被微生物利用后所產生的低分子直鏈淀粉。而對于蒸煮后的高直鏈玉米淀粉而言，除了高分子直鏈淀粉所呈現出的高被利用狀況外，與普通玉米淀粉一樣，其所含的少量的支鏈淀粉也被微生物消化利用，而低分子直鏈淀粉分子則呈現出在發酵后殘留淀粉顆粒中相對積累現象。這說明蒸煮過程中相對于高分子直鏈淀粉分子，低分子直鏈淀粉更易趨于排列成更為有序的狀態，從而體現出了其慢速發酵性?！緢D.略】
2.2 發酵過程中淀粉顆粒形態變化
2.2.1 原淀粉顆粒在發酵過程中的形態變化
通過SEM可以很清楚的顯示淀粉顆粒被微生物利用的過程。由圖2可見2種原淀粉顆粒發酵過程中形態的變化大不相同。對于普通玉米淀粉而言，微生物的利用是從表面和內部同時進行的，這說明這種淀粉的內部結構比較疏松。也有些報道稱這種淀粉表面及其內部有多孔的通道，在微生物發酵過程中可分泌多種酶系，在淀粉酶系作用下淀粉顆粒表面變得粗糙且多孔，這就為微生物在其表面吸附和進入內部提供條件。這也為微生物進一步發酵提供新的起點，即在前面所述的微生物及其分泌的降解酶特別是淀粉酶系在此階段開始快速利用淀粉顆粒中的無定形區，這和本試驗的排阻液相色譜所顯示在發酵的后期（12~24h）直鏈淀粉分子被快速利用的結構相吻合。
而對于高直鏈玉米淀粉而言，其微生物的利用途徑則完全不同。電鏡圖（圖2b）顯示淀粉顆粒被微生物利用的過程是逐步由表面向內擴散，這種利用方式可使淀粉顆粒的尺寸逐步變小，這種降解方式可能與其比較緊密的表面和內部結構有關聯，同時這種利用模式和用淀粉酶系測試結果相類似（結果將在近期發表）。因為高直鏈玉米淀粉中絕大部分是由直鏈淀粉所組成的，由本試驗色譜圖（圖2b）結果可知，高分子直鏈淀粉是逐步被降解消化的，結合相對應的SEM圖可能說明高分子直鏈淀粉主要是排布在淀粉顆粒的表面。但是各類淀粉分子是如何精確地分布在淀粉顆粒中仍要進一步的研究。
2.2.2 蒸煮后的淀粉顆粒在發酵過程中的形態變化
蒸煮導致淀粉顆粒的破碎，在發酵過程中對于普通玉米淀粉而言，在發酵前期形成片狀骨架結構（圖3a）。這可能是由于蒸煮過程中發生了淀粉分子的遷移以及相分離，也就是說容易被微生物所利用的淀粉分子凝聚集中于某些區域，從而被微生物降解后所剩余的淀粉形成了特定的形態，發酵后期微生物進一步利用殘留骨架，最后形成不規則的形態。
而對于高直鏈玉米淀粉而言，在發酵前期不形成這種骨架結構，但是其表面呈圓滑形態（圖3b）。這可能是因為其結構緊實，微生物及其產生的酶系由表面逐步利用這類淀粉，從發酵初期到發酵結束似乎均始終以此種由表及里的發酵模型進行。
3 結論
采用復合微生物發酵方法來研究淀粉的精細結構，這有區別于傳統的單酶或雙酶作用體系來研究淀粉的結構，前者具有獨到之處，這是因為淀粉顆粒雖然絕大部分是淀粉，但它仍存在少部分的脂肪、蛋白質、非淀粉質多糖與其它雜質，這些雜質的存在也會對淀粉的降解產生外部因素的影響。
本試驗非常有效地揭示出不同淀粉分子發酵的動力學，其中已經證實高分子直鏈淀粉分子（無論存在于普通玉米淀粉還是存在于高直鏈玉米淀粉）容易被微生物所利用。排阻液相色譜結果顯示高直鏈玉米淀粉中的低分子直鏈淀粉分子具有很強的抗降解性，這就為研究淀粉中各種淀粉分子在淀粉顆粒中的排布情況提供了有價值的信息。
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