低等動物不像高等脊椎動物可以提取骨髓制備染色體分散片,其染色體的制備方法較少,很多動物因為都沒能制備出合適的染色體片,而導致其相關遺傳學研究收到影響.國內關于低等扁蟲類染色體制備的方法最早見于李光鵬[1],一些研究者也曾進行過方法的改進[2,3],染色體制備方法的改進目的在于得到理想的結果,為進一步揭示它的生命現象本質提供可靠的遺傳資料,本研究在前人基礎上,采用離心重懸,對低等扁蟲染色體制備各環節進行了相應改進,以供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

采自南陽寶天曼的活體扁蟲數條

1.2 藥品

0.02%秋水仙素,0.1%KCL溶液,固定液I\\(酒精:冰醋酸:蒸餾水=3:3:4\\),固定液II\\(酒精:冰醋酸=1:1\\),固定液III\\(酒精:冰醋酸=1:4\\),5%Giemsa染色液.

1.3 方法

\\(1\\)再生組織的培養.取饑餓一周左右的健康蟲體,用單面刀片于咽前和咽后切斷蟲體\\(如圖1\\),片段放入培養皿加去氯自來水,控溫15℃左右\\(冬季室內即可\\),培養3~5天.

\\(2\\)分離再生組織.再生良好的片段,用毛筆輕輕移至培養皿蓋上,用單面刀片切下1mm左右的再生片段,放入去氯水的潔凈培養皿中,余下蟲體片段繼續培養,可用于有關再生的其他實驗.

\\(3\\)秋水仙素處理.分離得到的再生組織,加入少許0.02%秋水仙素\\(以能淹沒材料為宜\\),然后在培養箱\\(15℃左右\\)中,處理1.5~2.5小時,觀察材料狀況,以近似圓形或橢圓形無解體現象者為優.

\\(4\\)低滲處理.將處理良好的再生組織,用0.1%KCL溶液沖洗2-3次,再加入少許0.1%KCL溶液,后于培養箱內處理1~1.5小時左右.

\\(5\\)離心重懸.將上述低滲處理過的組織移入2ml離心管,用無菌大頭針輕輕搗碎.然后加入ml固定液I震蕩30s,后1000r離心,棄上清;再加入固定液II重復一次.

\\(6\\)固定分離后細胞.上述離心管中,加入1ml固定液III,震蕩30s,將混合液懸滴于干凈的載玻片上,室溫晾干即可.

\\(7\\)染色.上述制片用5%的Giemsa染液染色10-15分鐘左右,用蒸餾水輕輕洗去多余的染液,室溫晾干.

\\(8\\)封片.先在顯微鏡下粗略觀察,選擇染色體分散良好的涂片,用中性樹膠\\(二甲苯稀釋適中\\),封片保存.

2 結果

淡水扁蟲染色體分散片如圖2.

3 討論

離心重懸處理是本實驗的關鍵環節,它既可以去除細胞碎片的染色干擾,又可以使中期分裂細胞適度的破裂,得到分散良好的染色體結果.整個操作過程最好在室溫\\(20℃\\)左右進行,而材料處理過程在15℃左右的恒溫培養箱中進行,結果顯示:中期分裂相多,染色體形態完整清晰.溫度過高易導致操作過程和/或處理過程中扁蟲再生片段的解體,很難完成實驗.當然,以上幾個環節的操作可適當調整,進一步優化.

參考文獻

[1]李光鵬.淡水渦蟲染色體的制備方法[J].動物學雜志,1992,27\\(5\\):30-31.

[2]馬金友,陳廣文,劉德增.中國淡水三角渦蟲的染色體研究\\(I\\)[J].遺傳學報,2003,30\\(11\\),1045-1050.

[3]劉翔.淡水渦蟲染色體的制備方法[J].氨基酸和生物資源,2004,26\\(4\\):30~31.