花生（Arachis hypogaea L.）是世界主要油料作物，也是重要的植物蛋白來源，其種子含脂肪50%左右，含蛋白質約 25%.花生原產南美，其種植地區主要分布在亞洲、非洲和美洲，其中亞洲約占 60%,非洲約占 30%,美洲約占 5.5%.中國是世界第一花生生產和消費大國，與國內其他油料作物相比，花生在單產、含油量、單位面積產油量、種植效益、國際競爭力等方面具有明顯的優勢，使之成為最具發展潛力的油料作物之一。

穩定提高花生產量，改進花生抗逆性和營養品質，是花生遺傳改良的重要方向與目標?；蚬こ虨槔酶鼜V泛的基因資源進行花生遺傳改良提供了新的手段，可以通過外源基因導入及遺傳調控技術途徑提高花生的抗逆性和改良花生的營養品質，同時，花生基因工程技術的發展也顯示出花生在生物反應器方面的潛在應用價值.

許澤永等（2007）曾對轉基因花生研究進展進行了評述，近年來，在花生再生體系的研究取得較大進展的基礎上（Chu et al., 2008a; Bhatnagar et al., 2010）,在利用基因槍、農桿菌介導的目的基因遺傳轉化方面又有許多新的研究報道，常用的轉化方法主要有三類，一是基因槍法轉化胚性愈傷組織，通過體胚發生途徑分化再生；二是農桿菌介導轉化胚小葉、子葉（節）或胚軸外植體，通過體胚發生或器官發生途徑分化再生；三是農桿菌介導轉化莖尖外植體，直接發育成苗.目的基因主要包括提高對病毒、真菌、干旱、抗除草劑等抗性基因，在降低過敏原、高油酸等營養品質改良和生物反應器生產免疫產品等方面也開展了應用研究.本文結合本實驗室的相關研究工作，根據轉化的目的基因類型，對近年來花生基因工程研究新進展進行綜述，并對不同的轉化方法及其效果進行比較分析，以助花生基因工程研究工作的進一步深化.

1 花生的遺傳轉化方法

1.1基因槍法

Ozias-Akins等（1993）利用基因槍法將含 CaMV35S 啟動子的 hph 載體轉化花生幼胚，轟擊后 4~5 周在含5~10 mg/L 潮霉素的培養基上篩選 2 輪選擇抗性愈傷，再通過20 mg/L 潮霉素液體培養基篩選，Southern 雜交證實了 hph 基因的整合，轉化率（轉化細胞系/ 轟擊愈傷數）為 1%.后續該實驗室利用該體系進行了多次遺傳轉化方法改進及應用，建立了基因槍轉化重復發生胚性組織的方法。Deng 等（2001）用基因槍法通過未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑獲得轉hpt和gus基因植株。Joshi 等（2005）將綠色熒光蛋白（GFP）作為花生遺傳轉化的非破壞性標記，構建了 CaMV 35S 啟動子控制的增強 GFP （EGFP）和黃色熒光蛋白（EYFP）基因載體。利用基因槍法轉化Georgia Green 品種，通過與雙 35S 啟動子控制的具有AMV 增強子序列的載體 p524EGFP.1 進行比較，表明p524EGFP.1 和 pEYFP 的表達能檢測到較強的熒光信號，但與潮霉素相比，選擇效率較低.Chu 等（2013） 在改良基因槍轉化方法中用精蛋白代替亞精胺、并將每槍 700 ng DNA 降到 70 ng,轉化效率提高了 4.6 倍，但轉基因拷貝數也有顯著提高。

1.2根癌農桿菌介導法

1.2.1幼葉外植體的轉化

Eapen和George （1994）報道了農桿菌介導的花生葉盤轉化方法，Southern雜交證實了NPTⅡ 和 GUS基因的整合，但后代結實性差，沒有轉基因后代的遺傳分析.Cheng等（1997）報道，以花生10 d幼葉為外植體，培養于高濃度的細胞分裂素（25 mg/L BA）、低濃度生長素（1 mg/L NAA）培養基，與EHA 105菌株共培養2 d,7 d后進行抗生素篩選（150 mg/L卡那霉素）,生根培養基添加50 mg/L卡那霉素.與煙草葉片提取液共培養提高了GUS的瞬時表達活性.葉片外植體轉化率約為0.3%.在 T2轉基因花生植株中，GUS基因表達證實外源基因已整合到花生基因組并穩定表達。

1.2.2子葉外植體的轉化

Sharma和 Anjaiah （2000）用農桿菌 C58 菌株轉化成熟種子子葉外植體，基本培養基附加4.5 mg/LBA和 2.2 mg/L 2,4-D.2 周后用 125 mg/L 卡那霉素選擇，生根培養基不添加抗生素.誘導率和轉化率分別達到90%和 55%.后代 Southern 雜交顯示，8 株有nptⅡ的單拷貝。其后，該方法應用于花生從簇病毒外殼蛋白基因的轉化，在部分轉化體中檢測到1 個拷貝，至少一個轉化體表現出孟德爾遺傳.Swathi A-nuradha 等（2006）利用 JL-24 子葉節進行農桿菌介導的花生遺傳轉化，在MS 培養基附加 4 mg/L 2,4-D和0.1 mg/LNAA,與農桿菌 GV2260 共培養 3 d,4 d恢復培養后，用175 mg/L 卡那霉素篩選，誘導率達到45%,轉化率 31%,3.54%的轉化植株表現轉化基因的穩定整合.Bhatnagar 等（2010）進行無選擇標記載體的轉化JL24 子葉外植體，獲得經 Southern 證實的轉化后代.誘導率 32%~48%,轉化率 75%.

1.2.3 活體分生組織的轉化

Entoori 等（2008）應用農桿菌介導的活體莖尖分生組織體轉化方法，利用發芽種子胚軸接種農桿菌，然后直接成苗。獲得整合 Bt 基因 cry1X 的植株，并經 Southern 雜交得以證實。

2 目的基因轉化及目標性狀改良

2.1提高病毒病抗性

Higgins等（2004）以成熟種子胚性愈傷為外植體，利用基因槍法轉化病毒外殼蛋白（CP）基因，獲得對花生條紋病毒（PStV）高抗的花生。其抗性機制表現為RNA 介導抗性，表現抗病或免疫（沒有病毒復制）的轉化植株中檢測不到抗性蛋白的表達。而且在轉CP2 的 T0植株中檢測到轉基因特異的小 RNA.這些材料可為花生育種提供重要的抗性資源.Mehta 等（2013）通過農桿菌介導轉化子葉和幼葉將煙草條紋病毒（TSV）外殼蛋白（CP）基因轉入花生品種K6和K134,獲得抗性植株，PCR證實了T1、T2和T3的轉基因整合.單拷貝轉基因T3純系接種試驗，植株未顯病癥，幾乎沒有病毒積累，表明對病毒侵染具有抗性.RT-PCR實時定量PCR和ELISA證實了CP基因的表達.這項研究為創造花生莖疽病抗性材料提供了有效途徑.

2.2提高抗蟲性

徐平麗等（2003）以成熟花生胚軸為受體，通過農桿菌LBA4404 的侵染，將豇豆胰蛋白抑制劑（CpTI）基因轉入花生.PCR 檢測及 Southern 雜交鑒定證實外源基因的整合.通過抗蟲性檢測試驗，轉基因花生具有一定的抗蟲性.Entoori 等（2008）利用農桿菌介導的非組培方法（莖尖）將 Bt 基因 cry1X 轉入花生品種 TMV-2,生物檢測表明，T1植株對花生兩種主要害蟲棉鈴蟲和斜紋夜蛾具有抗性。ELISA 檢測證實了轉基因的表達，Southern 分析證實了轉基因的整合。

Tiwari 等（2008）將 35S 啟動子驅動的 δ- 內毒素Cry1EC基因通過農桿菌介導花生子葉轉化，獲得Southern 雜交證實的 T0單拷貝轉基因植株，實時定量PCR、Western 雜交和 ELISA 分析證實單拷貝 T1植株中Cry1EC的高表達，免疫測定表明Cry1EC的表達高達T1可溶性蛋白的 0.13%.飼葉試驗表明高表達轉基因植株的斜紋夜蛾二齡幼蟲致死率為100%.Tiwari 等（2011）將病程響應啟動子 PR-1a 驅動的δ- 內毒素Cry1EC基因用相同的轉化方法轉化花生，選擇非誘導表達非常低、在種子中不表達的轉化株進行試驗，水楊酸誘導后，Cry1EC在葉片中的表達量提高近 8 倍，水楊酸處理及斜紋夜蛾取食葉片在 2 d 后表達量達到最大。水楊酸誘導轉基因植株葉片對各齡幼蟲的致死率均達100%.