柑橘屬 （ Citrus） 是全球產量最大的水果，同時我國柑橘年產量位居全球第一[1].柑橘是亞熱帶植物，喜溫暖，對低溫的反應敏感，所以低溫是影響柑橘品質和產量的重要制約因素。同時低溫影響柑橘的區域分布，限制柑橘這一重要經濟植物在我國廣大北方地區的栽培種植。因此，研究柑橘寒敏感原因，培育柑橘耐寒品種，對于提高柑橘品質和產量，打破柑橘地域，促進柑橘產業快速發展具有重大意義。

基因差異表達分析技術是尋找植物抗性基因的重要技術手段，而基因工程是獲得植物抗性品種的重要方法，因此利用基因差異表達和基因工程技術能夠獲得柑橘抗寒相關基因，揭示柑橘寒敏感本質，有助于今后通過人工方法，調控柑橘抗寒過程，提高柑橘抗寒性，培育柑橘抗寒品種。迄今為止，已有 80 多篇涉及柑橘抗寒基因研究的文章發表，這些文章從柑橘屬植物溫州蜜柑、葡萄柚、甜橙中，分離鑒定了一部分低溫差異表達基因，分析了這些基因與植物抗寒性之間的關系，并通過基因工程轉化了部分柑橘類寒敏感品種，從而增加柑橘抗寒性。

1 柑橘抗寒相關基因獲得方法

高等生物的基因表達不僅受到發育和組織特異性的影響，而且還受到環境變化的影響。任何細胞的基因 90% 是基礎性表達，只有 10% 是選擇性表達。而生物表現出來的各種特性，正是由于這 10%基因的差異表達導致的，這里面包含了新基因的表達與表達量差異基因的表達。所以，分析低溫誘導下不同基因的表達差異，并克隆這些差異表達的基因與模式植物比對了解其抗寒功能，對于深入研究柑橘抗寒分子機理，獲得柑橘抗寒基因，轉化柑橘寒敏感品種，提高柑橘抗寒性具有重要作用。

獲得柑橘低溫差異表達基因的主要技術有mRNA 差異顯示 （ mRNA differential display） 、差別雜交 （ differential hybridization） 、交互扣除 RNA 差別顯示技術 （ reciprocal subtraction differential RNAdisplay） 、 扣 除 雜 交 （ subtractive hybridization ofcDNA） 、抑制消減雜交法 （ suppression subtractivehybridization ） 、 定 量 （ quantitative interpretation ）PCR、 半 定 量 （ semi-quantitative interpretation ）PCR、電子消減 （ electronic subtraction） 、基因表達系列 （ serial analysis of gene expression） 分析和DNA 微列陣分析 （ DNA microarray）[2].

2 柑橘抗寒相關基因及其作用

Weiser[3]在 1970 年首先提出，植物在抗寒性誘導過程中基因表達發生了改變。隨后利用各種基因差異表達分析技術，已在苜蓿、菠菜、冬小麥、馬鈴薯和冬油菜以及其他植物中，分離鑒定了多個與植物抗寒性相關的低溫誘導基因[4],而柑橘植物的抗寒相關基因也在研究中越來越多地被分離鑒定出來。

在柑橘的抗寒性基因研究中，柑橘被認為是對低溫比較敏感的植物，而同為蕓香科柑橘亞科的枳是與柑橘親緣關系很近的柑橘類植物，常用做柑橘砧木，對低溫抗性好，耐寒[5],是研究柑橘抗寒性很好的比較材料。在柑橘抗寒能力的研究過程中，科學家通過各種差異表達分析法在低溫脅迫的柑橘和枳中分離鑒定了一些低溫誘導基因，而這些基因的功能大多通過與模式植物中已知功能的抗寒基因進行同源序列比對得知，并比較其抗寒性的差異，分析柑橘寒敏感分子機理，旨在獲得能夠提高柑橘抗寒性的基因。陳文榮等[6]利用 mRNA 差異顯示技術分析鑒定寒敏感佛手低溫脅迫相關的基因，最終獲得 121 個低溫差異片段，經過半定量和生物學分析，最終確定 29 個上調基因和 5 個下調基因，這些基因主要涉及植物防御/應激反應，信號轉導，細胞壁修飾，轉錄，蛋白質的合成和氨基酸轉運。張真真[2]研究了低溫脅迫前后這些基因在佛手和枳的表達量變化情況，其中 14 個基因在佛手中的表達發生變化，但在枳中表達量卻不變，這些基因可能與佛手寒敏感相關，它們所介導的分子途徑可能是揭示佛手寒敏感特性的有利證據。近15 年來，柑橘類植物低溫脅迫后分離鑒定的低溫誘導基因列于表 1.在低溫脅迫后，植物能夠誘導體內表達某些基因，這些基因的表達蛋白直接參與低溫脅迫應答或間接調控其他靶基因的表達[20].陳得波等[21]歸納了自馬鈴薯、黑麥、小麥、菠菜、苜蓿和大麥以及其他植物里面分離鑒定的 62 個低溫誘導基因，這些基因與植物抗寒能力有關系，而且這些基因的作用與膜脂相變、抗凍脫水、抗凍活性及低溫下酶活性的變化有關。從表 1 中已經獲得的柑橘類植物低溫誘導基因，分析其合成的蛋白在抗寒中的作用可以分為 3 大類： 1） 編碼具有催化作用的蛋白；2） 促進新蛋白生成并附著細胞膜的表面或者鑲嵌在膜脂之間，對于細胞膜的冷穩定性有促進作用；3） 作為蛋白調節因子在信號轉導和低溫表達過程中起調節作用。下面對已經被分離鑒定的與柑橘低溫誘導相關基因在抗寒方面的作用進行介紹。

2. 1 酶活性蛋白

柑橘在低溫脅迫過程中誘導合成具有催化作用的蛋白，參與一些重要的生理活動，如苯丙氨酸解氨酶 （ PAL）[19]、ACC 合成酶[18]、硫氰酸酶[6]、甘油-3-磷 酸 酰 基 轉 移 酶[22]、核 苷 二 磷 酸 激 酶Ⅲ[16]、氨基酸透酶[16]、酮還原酶[11]等。

苯丙氨酸解氨酶 （ PAL） 是催化苯丙烷類代謝第一步反應的關鍵酶和限速酶。Sanchez-Ballesta等[19]從經低溫脅迫下寒敏感的福瓊橘 （ Fortune）和耐寒的赫南蒂娜克力邁丁紅橘 （ Hernandina） 中分離獲得 2 個全序列 PAL1 和 PAL2.研究發現低溫脅迫后寒敏感柑橘的 PAL 表達量升高而耐寒柑橘的 PAL 表達量和 PAL 活性均下降，表明低溫脅迫下 PAL 的表達量積累與柑橘受到低溫傷害有關，PAL 表達量的變化是區分柑橘品種抗寒性強弱的一種指標。

氨基環丙烷羧酸 （ ACC） 合成酶基因 ACS,是編碼乙烯合成的關鍵酶，乙烯主要調節植物的生長發育及多種生理反應，如植物逆境脅迫反應。

Wong 等[18]從低溫脅迫的甜橙中分離鑒定了 2 個低溫誘導表達的 ACC 合成酶基因 ACS1 和 ACS2,這2個基因不僅被低溫誘導表達，同時也被傷害誘導表達。

硫氰酸酶具有植物組織解毒作用，能使細胞中有毒的氰化物，轉變為無毒的硫氰酸化合物。陳文榮等[6]在寒敏感的柑橘植物佛手中，獲得硫氰酸酶基因，這說明即使是抗寒性差的柑橘植物種，也同樣會產生抗寒物質，用于對抗低溫下氰化物積累對細胞造成的傷害。

Lang[16]和 Zhang 等[11]利用 mRNA 差異顯示和定量 PCR 技術，從低溫馴化的溫州蜜柑中獲得 6個正調控低溫誘導基因，其中 2 個基因編碼具有催化作用的氨基酸透酶 6 和核苷二磷酸激酶Ⅲ。從低溫馴化的枳中獲得 8 個正調控基因，其中 1 個編碼具催化作用的酮還原酶。

2. 2 冷保護蛋白

低溫傷害的主要部位是生物膜，研究表明低溫脅迫過程中柑橘誘導新的蛋白質合成，附著于膜表面或位于膜脂間，具有保護細胞生物膜，維持水相，及防止蛋白變性等功能。如防止蛋白質受凍而失活的 COR （ cold-regulated） 蛋白[8,15],保護細胞機能及抗脫水的 LEA （ late-embryogenesis abundant）蛋白[8],及一些與 LEA 蛋白、脫水蛋白類似的蛋白[23 -25].在柑橘植物中報道最多的 COR 基因有 COR11,COR15,COR19,這 3 個基因受低溫、高鹽、干旱等逆境誘導，能形成一類獨特的 LEA 蛋白基因家族，均與柑橘的抗寒性相關。Porat 等[8]從葡萄柚中獲得 COR15 基因，編碼一個 15. 1 ku 的蛋白質COR15.Hara 等[15]從低溫馴化的溫州蜜柑葉片中獲得 COR19 基因，從枳中獲得 CORc115 基因和CORc119 基因，分別編碼蛋白質 COR19 和 COR11.這 2 種基因和溫州蜜柑低溫誘導表達的 COR19,氨基酸序列都富含賴氨酸豐富區[24],且高度同源。