引 言

吡咯喹啉醌 \\( PQQ\\) 是 異 于 NAD/NADP 和FMN / FAD 的新型輔酶,能刺激微生物生長、促進神經細胞和生長因子的合成、調節機體自由基水平、保護腦功能、增強對毒性和輻射的耐受性,并且有望成為治療帕金森病的候選藥物。迄今發現能合成 PQQ 的生物主要是革蘭氏陰性菌,包括副球菌屬\\( Paracoccus\\) 、假單胞菌屬\\( Pseudomonas\\) 、乙酸鈣不動桿菌屬\\( Acinetobacte rcalcoaceticus\\) 、甲烷單胞菌屬\\( Methanomonas\\) 、甲基芽孢桿菌屬\\( Methyloba-cillus\\) 、甲基單胞菌屬\\( Methylomonas\\) 等。但絕大多數菌株發酵產率低,難以實現工業化。肺炎克雷伯氏菌\\( Klebsiella pneumoniae\\) 的 PQQ 合成涉及 6個基因構成的基因簇\\( pqqABCDEF\\)。目前 PQQ的合成機制尚未完全闡明,定向改造其代謝途徑存在難度。

全局轉錄工程\\( gTME\\) 是用易錯 PCR 對 RNA聚合酶的 σ 亞基或其他轉錄元件進行突變,通過改變 σ 亞基與啟動子區域的親和力,從而影響基因的轉錄程度。σ 亞基的突變文庫能結合大量啟動子,可在轉錄組水平上大范圍地影響基因轉錄,從而導致細胞代謝流量再分配,是一種全新的分子育種策略。據報道 K. pneumoniae 的 σ 因子包括 rpoD、rpoE、rpoH、rpoN、rpoS 等,其中 rpoD 為首要因子。轉錄過程中,提高 RNA 聚合酶對啟動子區域的親和力,可增強轉錄的強度。本文基于 gTME 策略,通過易錯 PCR 構建 rpoD 基因的突變庫,與載體連接后電轉化 K. pneumonia DSM2026 構建突變菌株,從大量重組子中篩選 PQQ 高產菌。

1、 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌株與載體

肺炎克雷伯氏菌\\( K. pneumonia DSM 2026\\) 及表達載體 pET-PK 由本實驗室保存和構建,其中PK 代表甘油脫水酶基因 \\( GenBank U30903 \\) 自身的啟動子。肺炎克雷柏氏菌 PQQ 基因簇示意圖如圖 1。

1. 1. 2 培養基與試劑

LB 液體培養基\\( g / L\\) : 蛋白胨 10,酵母提取物5,氯化鈉 10,pH 7. 0。LB 固體培養基需加入 1. 5%的瓊脂。發酵培養基: 5 × M9 鹽溶液 200 mL,1 mol/L MgSO42 mL,20% 葡萄糖 20 mL,1 mol / L CaCl20. 1mL,加滅菌的去離子水至 1000 mL。5 × M9 鹽溶液\\( g/L\\) : Na2HPO4·7H2O 64,KHPO415,NaCl 2. 5,NH4Cl 5. 0。NBT-Gly 溶液: 20 mmol / L 磷酸鹽緩沖液 PBS\\( 0. 2mol/L Na2HPO4,0. 2mol/L NaH2PO4,pH 7. 0\\) ,NBT-GlyK+溶液\\( 預先配制 2 mol/L Gly-KOH 溶液,pH 10\\) ,使用時加入氯化硝基四氮唑藍\\( NBT\\) ,終濃度為 0. 24 mmol/L。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 擴增目的基因 rpoD

在 NCBI 查得 K. pneumoniae 的 rpoD 基因序列\\( GenBankACI07699\\) ,設計引物,以 K. pneumoniae基因組為模板,進行 PCR,擴增 rpoD 基因。上游引物的酶切位點為 EcoR I,下游引物的酶切位點為 SalI,下劃線序列為引入的酶切位點。

1. 2. 2 轉化重組質粒

將切膠回收的 rpoD 基因和 pET-PK 表達質粒用EcoR I 和 Sal I 于 37 ℃ 下酶解 2 h,用 T4 DNA 連接酶 16 ℃ 連接過夜,構建對照組 rpoD 的重組質粒pET-PK-drpoD。將該重組質粒電轉化感受態的 K.pneumonia DSM2026,復蘇后涂布于含卡那霉素的LB 固體培養基,37 ℃ 培養過夜。挑取單菌落進行菌落 PCR 和質粒雙酶切鑒定。陽性克隆命名為 K. p\\( pET-PK-drpoD\\) ,其中 drpoD 意指未進行突變的 rpoD基因。

1. 2. 3 構建突變庫

以 rpoD 基因為模板進行易錯 PCR,反應體系25μL: Taq DNA 聚合酶緩沖液 2 μL,上下游引物均為0. 5 μL,模板 0. 5 μL,dATP 和 dGTP 0. 2 mmol / L,dCTP 和 dTTP 0. 6 ~ 1 mmol / L,Mg2 +2 ~ 4 mmol / L,rTaq DNA 聚合酶 0. 4 μL。易錯 PCR 反應參數為 95℃ 3 min,94 ℃ 1 min,55 ℃ 50 s,72 ℃ 2 min,進行 30個循環; 72 ℃10 min,16 ℃保存。用 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR 產物。

將切膠回收突變 rpoD 基因和表達質粒 pET-PK用 EcoR I 和 Sal I 于 37 ℃下酶解 2 h,T4 DNA 連接酶連接過夜,構建重組突變質粒 pET-PK-trpoD,得到突變文庫,其中 trpoD 意指突變的 rpoD 基因。

1. 2. 4 轉化重組突變質粒及篩選陽性克隆

將重組突變質粒 pET-PK-trpoD 電轉化感受態的 K. pneumoniae DSM2026,復蘇后涂布于含卡那霉素的 LB 固體培養基,37 ℃培養過夜,挑取單菌落進行菌落 PCR 鑒定。

1. 2. 5 重組菌發酵

對照菌 K. p \\( pET-PK-drpoD\\) 及重組菌 K. p\\( pET-PK-trpoD\\) 進行24h 搖瓶發酵,設置3 組平行,每隔 3 h 取發酵液,測定吸光度,繪制生物量曲線。

1. 3 分析方法

采用 NBT-Gly 法定性檢測 PQQ。300 μL 反應體系包括20μL PQQ 發酵液,80μL PBS,180μL Gly-KOH,20 μL NBT,30 ℃ 避光反應 1 h。吸打混勻后加入到 96 孔酶標板,以去離子水代替發酵液作對照,在波長 530 nm 下測吸光度 A,PQQ 產量與 A 值成正比。提取重組菌 K. p\\( pET-PK-trpoD\\) 的質粒進行測序。

2、 結果與討論

2. 1 對照菌 K. p\\( pET-PK-drpoD\\) 的構建

以 K. pneumoniae 基因組為模板 PCR 擴增 rpoD基因,如圖 2 所示,在 2000 bp 左右出現條帶,與GenBank 公布的 rpoD 基因\\( 1842 bp\\) 相符。將重組質粒 pET-PK-drpoD 電轉化至感受態 K. pneumoniaeDSM2026,涂布平板培養后挑取單菌落進行培養,提取質粒進行雙酶切鑒定,得到質粒 pET-PK \\( 約5400bp\\) 和 rpoD 基因條帶 \\( 約 1800 bp\\) ,證明重組質粒pET-PK-drpoD 成功轉化到 K. pneumoniae DSM2026中。

2. 2 突變庫的構建

以 rpoD 基因為模板,進行易錯 PCR 反應。如圖 3 所示,泳道 1 ~ 10 所含 dCTP 和 dTTP 濃度相等,其中泳道 1、4、7、10 濃度為 1 mmol/L,泳道 2、5、8 濃度為 0. 8 mmol / L,泳道 3、6、9 濃度為 0. 6 mmol /L。此外泳道 1 ~ 3 Mg2 +濃度為4mmol/L,泳道4 ~6Mg2 +濃度為 3 mmol/L,泳道 7 ~ 10 Mg2 +濃度為 2mmol / L。從產量上看,以泳道 3 的條件為最優。用大體系\\( 100 μL\\) ,最佳條件進行易錯 PCR 反應,切膠回收 PCR 產物,純化后的突變 rpoD 基因和 pET-PK 表達質粒用 EcoR I 和 Sal I 于 37 ℃ 下酶解 2 h,T4DNA 連接酶 16 ℃ 連接過夜,構建重組突變質粒pET-PK-trpoD。將重組突變質粒 pET-PK-trpoD 電轉化 K. pneumoniae DSM2026,得到突變文庫。

2. 3 重組菌陽性克隆的篩選

將突變質粒 pET-PK-trpoD 電轉化到感受態的K. pneumoniae DSM2026,涂布培養,挑取單菌落進行菌落 PCR 鑒定\\( 圖 4\\) ,電泳顯示大約 1800 bp 處有條帶,證明重組突變質粒 pET-PK-trpoD 已轉化至K. pneumoniae DSM2026 中。

2. 4 重組菌發酵生產 PQQ

重組菌 K. p\\( pET-PK-trpoD\\) 的生物量曲線如圖5 所示。在對數生長期其生長速度和生物量明顯快于對照菌 K. p\\( pET-PK-drpoD\\) ,發酵3h 后進入平穩期,表明發生突變的 rpoD 影響了相關基因的表達,有利于細胞生長和代謝; 進入平穩期后重組菌生長速度和生長量與對照菌基本持平,推測是對數生長期 PQQ 的過表達消耗了大量葡萄糖,從而無法維持菌體的對數生長。

重組菌 K. p\\( pET-PK-trpoD\\) 的 PQQ 產量如圖 6所示。從第 3 h 開始重組菌的 PQQ 高于對照菌,且其最高產量達到 76 mg/mL,比對照菌提高了約10% 。這是因為 rpoD 基因的突變擾動了胞內基因的轉錄,代謝流發生重排,強化了 PQQ 的合成途徑。由于輔酶與酶蛋白之間存在嚴謹的依存關系,微量輔因子即能極大擾動整個細胞代謝,因此 PQQ 遠不可能達到乙醇和乳酸那樣的產量。

將突變 rpoD 基因測序結果與 GenBank 中的rpoD 基因序列進行 Clustal W2 程序比對,發現 1842個堿基中的突變堿基為 46 個,無堿基缺失現象。翻譯出的氨基酸殘基中有 3 個發生了突變,分別為D200E、E332G、T569A,突變率為 0. 5% ,如圖 7。

用 SOPMA 在線程序\\( http: ∥www. expasy. ch/tools\\) 對突變后 rpoD 蛋白質的二級結構進行預測并與突變前相比,發現突變前 α 螺旋、伸展鏈、β 轉角和無規則卷曲的數目分別為 424、31、31、127,突變后的相應數目分別為 418、38、31、126,可見突變的 3個氨基酸殘基對 σ 二級結構產生了較大影響,進而影響了 RNA 聚合酶對啟動子的親和力。

3、 結論

用易錯 PCR 構建了 K. pneumoniae 的 rpoD 基因突變文庫,與載體連接后轉化 K. pneumoniae,從約1500 株陽性克隆中篩選了一株 PQQ 生產菌,其產量比對照菌增長了 10%。測序發現其核酸和蛋白水平的突變率分別為 2. 5% 和 0. 5%。二級結構預測發現其 α 螺旋、伸展鏈、β 轉角和無規則卷曲的數目均發生了變化,推測因此影響了 σ 因子與啟動子的識別與結合,從而導致轉錄變化和代謝流量再分配。