前言

高爾基體糖蛋白 -73（GolgiProtein73, GP73）又稱Ⅱ型高爾基體膜蛋白 \\(Golgi phosphoprotein2,GOLPH2\\) 和高爾基體膜蛋白1（Golgi membrane pro-tein1, GOLM1），因其相對分子質量為7.3×104而命名為 GP73。新近的研究發現 GP73與肝臟疾病、尤其與肝癌密切相關，有望成為繼 AFP 后靈敏度、特異性更高的肝癌血清學標志物。但作為新的標志物，GP73需要更廣泛的實驗室及臨床對照試驗加以驗證。為進一步探討 GP73與肝癌的關系，及其在肝癌診治中的作用，本研究從肝癌細胞系中克隆 GP73基因，表達及純化 GP73蛋白，旨在為后續研究提供基礎。

1、材料與方法

1.1材料來源原核表達載體 pET-21a\\(+\\)-TRX 由本實驗室在 pET-21a\\(+\\) 的基礎上改建而成、腫瘤細胞系 HepG2、大腸桿菌 DH5α、感受態 BL21（由本實驗室保存）；RNA 抽提試劑盒、DNA 聚合酶、RT-PCR 試劑盒、蛋白 Marker、T4DNA 連接酶、質粒抽提試劑盒（Ferments 公司）；His-tag 磁珠純化試劑盒（日本Toyobo 公司）。

1.2目的基因的擴增HepG2細胞常規培養至對數生長期，抽提總 RNA，以此為模板，RT-PCR 擴增 GP73基因的全長序列，根據 pET-21a\\(+\\)-TRX 及GP73的序列，設計克隆引物：5'-CGCGGATCCGATGATGGGCTTGGGAAACGG-3'，3'端引物如下：5'-CCCAAGCTTGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACG-3'。在5' 端和3' 端引物分別引入 BamH Ⅰ酶切位點和 Hind Ⅲ酶切位點。PCR 擴增條件：95℃1min，60℃30s，68℃1min30s，35個循環后，68℃延伸10min。產物經電泳回收純化。

1.3酶切及連接反應用限制性內切酶Bam HⅠ、Hind Ⅲ雙酶切 pET22a\\(+\\)-TRX 及 GP73PCR 產物，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并分別回收，T4DNA 連接酶連接，連接后構建pET22a\\(+\\)-TRX-GP73。

1.4重組質粒轉化感受態細菌DH5α將100μLDH5α 感受態細菌放入提前預冷的無菌離心管中，加入5μL 連接產物，混勻后冰上靜置30min；42℃熱激90s 后，立即置于冰上2min；將熱激后的細菌加入900μL LB 液體培養基中（37℃預熱），100rpm，37℃振搖45min；取100μL菌液涂布于含50μg·mL-1Amp 的 LB 瓊脂平皿上，于37℃細菌培養箱中倒置培養12～16h。

1.5重組質粒的鑒定從轉化平皿中挑取單菌落進行擴大培養，用菌落 PCR、雙酶切鑒定。選取經雙酶切鑒定和菌落 PCR 均為陽性的克隆送上海英駿生物技術有限公司進行DNA 雙向測序驗證。

1.6重組蛋白TRX-GP73的原核表達及純化從 DH5α中抽提重組質粒pET22a（+）-TRX-GP73，將重組質粒轉入大腸桿菌 BL21（DE3）中，IPTG 誘導表達。為了獲得蛋白表達的最佳 IPTG 誘導濃度、誘導時間和誘導溫度，本實驗選擇的 IPTG 終濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mmo·lL-1，并分別于30℃、37℃條件下誘導1h、2h 、4h、6h、8h、10h后收集細菌，進行 SDS-PAGE 電泳鑒定，選擇最佳誘導條件誘導表達。然后，按 ToYoBo His-tag 磁珠純化試劑盒說明書步驟純化目的蛋白 GP73，純化產物經 SDS-PAGE 電泳鑒定。

2、結果

2.1目的基因的擴增抽提 HepG2細胞總 RNA，RNA 質量好，無降解，以 RNA 為模板，RT-PCR 擴增 GP73基因的全長閱讀框架序列，PCR 產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳后，在1200bp 可見清晰條帶，大小與預期相符。目的基因經測序，大小與理論值一致，無突變，無移碼現象。

2.2酶切及連接反應pET22a\\(+\\)-TRX 及 GP73PCR 產物用限制性內切酶 Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切，37℃水浴過夜后，1％瓊脂糖凝膠電泳并回收，按照 PCR 產物 / 載體3:1的摩爾比率將雙酶切后的PCR 回收產物載體連接。

2.3重組質粒的鑒定從轉化平皿中挑取單菌落進行擴大培養，用菌落 PCR、雙酶切鑒定（圖1），選取兩者均為陽性的克隆送上海英駿生物技術有限公司進行 DNA 雙向測序驗證。測序結果經比對，其大小與理論值一致，無突變，無移碼現象，GP73基因序列已成功插入空載體 pET21a\\(+\\)-TRX 中。結果表明成功地構建了重組質粒 pET21a\\(+\\)-TRX-GP73。

2.4重組蛋白TRX-GP73的原核表達及純化實驗結果提示，重組蛋白 TRX-GP73的最佳誘導條件為1.0mmol·L-1，10h，37℃（圖2）。將轉入 pET21a\\(+\\)-TRX-GP73的表達菌株 E.ColiRosetta\\(DE3\\)經1.0mmo·lL-1IPTG誘導10h后裂解，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE 電泳發現 GP73主要以可溶性的形式存在于上清中，將上清經 His-tag 磁珠純化試劑盒純化后可在80kD 左右見一清晰目的條帶，與預期相符（圖3）。

3、討論

2000年，美國學者 Kladney 等在研究成人巨大細胞性肝炎 \\(giant-cellhepatitis, GCH\\) 時，第一次發現了定位在高爾基體上的蛋白 GP73，人 GP73基因位于第9號染色體，全長3042bp，編碼大小為73kD 的糖蛋白，稱為GP73蛋白質研究表明 GP73在正常人體的多個器官組織中均有表達，推測該蛋白質具有管家基因功能，但表達水平相差很大，表明 GP73可能存在組織和（或）細胞的特異性調控。在正常肝臟中，大部分肝細胞不表達 GP73，僅有少量位于匯管區的肝細胞低表達 GP73。

2002年，Kladney 等發現 GP73高表達于肝炎和肝硬化患者的肝組織中，表達量是正常肝組織的70倍，而各病理組之間無顯著差異。2004年，Iftikhar 等研究同樣發現 GP73在急性肝炎和進行性肝硬化患者中表達明顯增高。2005年，Marrero采用蛋白質印跡技術對144例肝癌患者、152例肝硬化患者及56例健康對照者的血清標本進行分析，以10個相對強度單位作為閥值，GP73檢測肝癌的靈敏度為69％，特異性為75％。而GP73用于早期肝癌診斷的敏感性為62％，遠高于AFP（25％）。AFP 水平低于20μg·L-1的肝癌患者中，57％（32/56）的 GP73水平顯著升高。

2013年，Shan SG 等研究發現，GP73在血清中的表達水平隨慢性肝病的進展（肝炎 -肝硬化 -肝癌）而逐漸升高，提示其可作為慢性肝病患者疾病惡化的預警指標。

現有的研究表明 GP73與肝臟疾病密切相關，尤其在肝癌患者血清及肝癌組織中呈現高表達，因此有望成為肝癌早期診斷的血清標志物。本研究從肝癌細胞系中克隆 GP73基因，采用基因重組技術構建 pET-21a\\(+\\)-TRX-GP73原核表達載體，摸索最佳的 IPTG 誘導表達條件，使其在 BL21（DE3）中得以高效表達，并采用 His-tag 磁珠吸附、洗脫重組蛋白 GP73。我們通過試驗對比發現：與Ni- 柱純化法相比較，雖然 His-tag 磁珠法純化的蛋白濃度較低，但是能顯著提高GP73蛋白的純度，為后續的研究提供了更優質的蛋白樣品。