MicroRNA（miRNA）作為一種轉錄后調節因子在基因表達調控中發揮重要作用。它是一類廣泛存在于真核生物中、長約22nt的內源性非編碼小RNA分子，通過組裝進RNA誘導的沉默復合體（RNA-in-ducedsilencingcomplex,RISC）與靶基因3'非翻譯區（untranslatedregions,3'UTR）結合，根據miRNA與靶mRNA之間互補程度的不同導致靶基因降解或者阻遏靶mRNA的翻譯.自1993年在線蟲中首次發現miRNA至今，大量研究表明miRNA可通過精細調節基因的表達參與細胞發育、分化、增殖、凋亡以及應激反應等過程，其表達的組織特異性和時空特異性使其在多種生物學過程中發揮重要調節作用.據推測人類有超過1/3的基因受miRNA調控，而確定miRNA靶基因是研究miRNA生物學功能的關鍵。目前確定miRNA靶基因主要靠生物信息學預測和生物學實驗方法進行驗證，前者主要根據經實驗觀測得到的miRNA及其靶基因之間序列識別的規律性進行設計.應用較普遍的幾個軟件有miRanda,TargetScan和RNAHybrid.miRan-da作為第一個基于序列的預測算法從序列匹配，靶位點的保守性及雙鏈結合的自由能角度進行分析，有比較好的檢出率；TargetScan主要考慮物種間保守的miRNA靶基因，通過“種子匹配”可進一步增加預測精度；RNAHybrid的研究重點則在于RNA二級結構預測方面，通過動態規劃尋找雙鏈雜交的最優自由能鑒別miRNA的靶點，具有明顯的速度優勢.然而單純依靠序列信息所得到的預測結果仍存在較多的假陽性，難以提高miRNA靶基因的預測效能。有研究表明，與基于序列的方法相比，利用在相同樣本中檢測到的miRNA和mRNA表達譜可以更準確地預測miRNA靶基因，更好地揭示miR-NA和靶基因的綁定關系.
管家基因（house-keepinggene）指的是在生物體幾乎所有細胞中廣泛而穩定表達的基因，也稱為看家基因或持家基因，如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。這類基因對于維持細胞的基本結構和代謝，保證細胞存活生長并在維持細胞最低限度功能上發揮關鍵作用。目前國際上有關miRNA對管家基因調控的研究尚不充分，現有報道多集中于分別通過個別基因作為管家基因和非管家基因的代表來探討miRNA的調控作用，如以編碼核糖體蛋白的基因、氧化磷酸化的基因代表管家基因，以與神經元相關的基因代表非管家基因.盡管結果顯示miRNA較少靶向編碼核糖體蛋白的基因，但由于少數基因的代表性不強，因此這些研究的結論并不能很好地反映兩類基因的整體特征。其次在Cheng等有關miRNA調控管家基因的研究中，雖然以整體管家基因作為研究對象，但僅單獨利用軟件進行預測所得到的miRNA對靶基因的調控關系中存在假陽性較高的問題，結果的可靠性值得懷疑，并且僅依賴miRNA綁定的數目作為評價指標難免導致結果存在偏差。
通常，生物在進化過程中需要適應各種多變的細胞環境，而在諸多組織中表達的基因在選擇壓力和個體適應性上表現出的顯著優勢使得它們能夠在多種生存環境下發揮功能，保證機體正常運轉。特別是在維持細胞基本結構和代謝功能中發揮保障作用的管家基因，有研究表明其表達的蛋白質同更多的分子發生相互作用并且在廣泛改變的細胞環境下行使功能，這些基因受到各方面的約束限制從而減少了序列分歧.此外，miRNA和mRNA的3'UTR序列之間的識別機制主要在于miRNA核心區域即種子序列的匹配，生物進化過程中miRNA和靶基因所表現出的協同相互作用以及彼此的約束使得種子區域對突變非常敏感，稍有變異就會失去miRNA對其的調控，從而導致靶基因表達水平的劇烈變化.有鑒于此，從進化的層面進行研究有利于進一步揭示miRNA對管家基因調控的重要性。
考慮到已有研究中所存在的問題以及miRNA在基因表達調控中的重要作用，我們系統地整合了3個目前國際主流的基于序列的靶基因預測軟件結果，并結合基因表達譜信息進行聯合分析，同時還考慮到3'UTR長度的影響，將miRNA綁定的密度作為主要評定指標，從整體水平來研究miRNA對管家基因和非管家基因調控的差異，進一步利用數十個物種通過phastCons進化分析探討3'UTR區域的保守性之間的差異，明確了這種調控差異與基因3'UTR進化保守性之間的關系。
1 材料和方法
1.1 數據來源和統計分析方法
參考Eisenberg等的工作共獲得了人類575個管家基因的列表，該列表是目前國際上相關研究中最常用的管家基因列表，具體是通過使用Affy-metrixU95芯片的微陣列檢測47個不同人類組織和細胞系的101個不同樣本所產生的表達譜數據,以每個組織或細胞系的平均表達水平作為閾值,將在所有組織中都高于其相應平均水平的基因識別為管家基因。人類參考基因組數據來自NCBI下GRCh37版本（所對應的UCSC版本號：HG19）,通過該數據庫公布的信息對應得到566個管家基因并將剩余的32021個基因作為非管家基因，同時也分別獲取了兩類基因相應的3'UTR信息，經過EMBOSS軟件去除polyA尾后得到3'UTR序列。miRNA靶的預測數據從miRNAMap2.0數據庫下載得到，該網站存儲了后生動物基因組中已通過實驗驗證的miRNA及其靶基因，并分別利用TargetScan、miRanda和RNAhybrid預測出miRBase9.2中公布的人類475個成熟miRNA序列對靶基因的調控關系。
mRNA和miRNA的表達譜數據分別來自NCBI的GEO數據庫中GPL96平臺下GDS596所提供的編碼基因在79個人類組織中的表達水平以及使用Q-PCR的方法獲得的240個miRNA在人類14個正常組織（包括心、肝臟、腎臟等）中的表達水平.數據統計分析的部分利用R語言實現，顯著性檢驗采取wilcoxon秩和檢驗。
1.2 整合多種基于序列的預測方法識別miRNA靶基因
分別采用3個常用軟件TargetScan、miRanda和RNAHybrid對靶基因進行預測，在識別靶位點時遵循以下原則：①每個靶基因上需包含多個靶位點；②通過Sfold實現靶位點的可接近性，即保證miR-NA所到達的區域是mRNA上易被綁定的區域。根據上述原則將得到的3個軟件預測結果進行整合分析，根據“靶位點至少被3個軟件中的兩個預測到”這一條件對各軟件預測結果取交集，從而在靶基因上篩選出相應的靶位點?？紤]到同一miRNA會調控相同mRNA的不同位置，并且這些區域都可能被兩個以上的軟件預測到，我們把該區域的數目作為miRNA在靶基因上的綁定數量，最終將整合的靶基因預測結果同前述管家基因和非管家基因相對應，獲得miRNA對這兩類基因的調控關系。
1.3 基于序列和表達信息的聯合分析預測miRNA靶基因
基因表達信息通過樣本均一化處理，構建出各包含有14個組織的12625個mRNA和240個miR-NA的表達譜數據矩陣（miRNA:240×14;mRNA:12625×14）,這些組織在兩個表達譜矩陣中是一致的。采用Pearson相關系數構建mRNA和miRNA的相關性矩陣（12625×240）,并根據以往報道中提到的在多數情況下miRNA對mRNA的負性調節作用,以0為閾值篩選出相關系數小于0的miRNA-mRNA作為潛在靶對。得到基于表達信息預測出的人類miRNA對靶基因的調控關系后，再同基于序列的預測結果取交集，重新獲得miRNA在兩類基因上的靶向信息。而后以-0.54作為相關系數閾值（通過樣本相關性t檢驗得到，P=0.05）重復上述過程。其中在聯合分析中，由于基于表達譜的預測沒有顯示miRNA在mRNA上綁定的位置信息，所以從miRNA出現的數目上進行統計，針對以上兩種方法均呈現出的調控關系進行后續分析。
1.4 3'UTR區域的保守性分析
使用phastCons方法比較管家基因和非管家基因上3'UTR區域的保守性，這是基于phylo-HMM開發的用于描述基因組中每個位點下DNA替換的過程以及轉變方式的概率模型，通過45個脊椎動物基因組的多序列比對描繪出每個位點下的保守性分值，反映物種系統發生過程；該方法不同于其他保守性打分的程序，不依賴于固定大小的滑動窗口，短序列高度保守的區域以及較長的比較保守區域可以獲得較高的分值，可表征每個位點處堿基保守性的概率.從UCSC-Download下載人類基因組HG19版本下每條染色體包含的每個基因上各位點的phastCons分數,以0~1之間的數值表示，并將phastCons分數≥0.9的作為保守位點得到每條染色體上每個基因的保守區域信息；同時又從UCSC-TableBrowser中下載到相同參考基因組條件下每個基因3'UTR的位置信息。通過將以上兩種信息應用到bedtools軟件的coverageBed程序中并同管家基因和非管家基因相對應，最終分別得到兩類基因的3'UTR上保守區域所占的比例，從而進行保守性比較。
2 結果
2.1 管家基因上miRNA的調控密度顯著高于非管家基因
通過生物信息學軟件預測尋找miRNA對兩類基因的調控差異，對于475條人類成熟的miRNA序列，首先利用TargetScan、miRanda和RNAhybrid3個軟件分別得到244389、1062973以及1009616個靶位點。為了降低假陽性，將各軟件的預測結果取交集后分別得到miRNA對262個管家基因和7495個非管家基因的調控關系，結果發現兩類基因中3'UTR的長度存在明顯差異，與以往文獻報道一致,同時發現兩類基因在總體靶定的數目上并沒有顯著差異（表1）.分別將3個軟件各自的預測結果進行統計分析，發現彼此之間的預測結果并不完全一致（表2）.為了排除3'UTR長度對總數目所產生的影響，利用miRNA調控的數目與UTR長度之比對miRNA在靶基因上的綁定情況做均一化處理，以miRNA綁定的密度作為衡量miRNA對兩類基因調控差異的主要標準。結果發現管家基因上miRNA綁定的密度顯著高于非管家基因（P=6.2508E-24,Fold=1.3352,見表1）.
【表1 2】
2.2 整合基于表達譜的方法證明miRNA對兩類基因調控的密度差異
有研究表明加入表達信息能夠有效提高預測精度，有利于更加明確miRNA和靶基因的綁定關系,為此在軟件預測的基礎上引入表達譜數據進行分析。由于miRNA負調控靶基因的表達，因此通過mRNA與miRNA的Pearson相關系數<0的指標在表達譜相關性矩陣中篩選兩者之間的相互作用，分別得到miRNA對兩類基因的調控（表3）.這里所獲得的候選樣本數量同基于序列的預測結果基本持平，在wilcoxon秩和檢驗下254個管家基因的miRNA綁定密度也同樣顯著高于5688個非管家基因的，而數目分布依然沒有差異，這與2.1的預測結果是一致的，并且倍率（Fold=1.5948）比之前有所提高，說明我們所采取的基于序列和表達譜信息的聯合分析在預測miRNA對靶基因的調控上是可靠的。
【表3】
為進一步優化預測結果，期望通過miRNA與mRNA之間具有統計顯著性的負調節關系來反映生物細胞中更加真實的調控情況，利用14個組織的t檢驗得到的相關系數-0.54（P=0.05）作為雙鏈之間反向調控的新臨界值，構建出基于表達信息和軟件預測的聯合分析結果（表4）,結果可見93個管家基因和1819個非管家基因在miRNA綁定密度的統計學檢驗中依然呈現出與之前預測結果相同的趨勢。樣本數量的下降使得P值（P=3.8454E-08）雖然沒有之前顯著（P=9.1890E-17）,但是Fold值得到了進一步提高（Fold=1.6122）.
【表4】
2.3 管家基因3'UTR上的保守區域顯著高于非管家基因
為了從進化層面探索miRNA對管家基因的調控，進一步考察miRNA對兩類基因調控的密度差異同3'UTR區域的保守性之間的關系，利用phastCon分數比較兩類基因3'UTR區域的保守性，結果可見3'UTR上的保守區域分布中566個管家基因的保守區域（phastCon分數≥0.9）平均占有比例為25.60%,顯著高于32021個非管家基因（保守區域平均占有比例=16.75%,P=5.1658E-26）.同時，對保守位點的統計發現在兩類基因的3'UTR上只存在非保守區域（phastCon分數<0.9）的基因分別占了8.5%（HK）和19.5%（Non-HK）,從而反映出管家基因中保守性序列占有的區域較大，3'UTR在進化中也就更加趨于保守。由于3'UTR是miRNA與靶基因相互作用的主要區域，是miRNA參與基因調控的主要調控元件，因此其在管家基因中的進化保守性較高提示可能與管家基因miRNA調控密度具有相關性。
3 討論
管家基因作為維持細胞最低限度功能并使其存活生長所必需的蛋白質編碼基因，其表達產物對于生物體的基本生命活動是必須的，而作為基因轉錄后調控因子的miRNA通過精細調節基因表達在諸如生長發育等多種生物學過程中發揮著重要作用。
鑒于每個miRNA可以調控幾十個甚至上百個靶基因，因此準確鑒別出miRNA在管家基因和非管家基因上的靶點具有重要意義。之前有關此方面的報道有的專注于個別基因進行討論從而不具有代表性，有的只采取單一的靶基因預測軟件導致miRNA對管家基因的調控結果不可靠，并且單純以miRNA綁定的數目作為衡量指標而沒有考慮3'UTR的長度來進行研究，降低了結果的可信度。本研究在考慮到上述問題的基礎上從全局的整體水平來分析miRNA對兩類基因的靶向性特點，理論上更具有代表性。
通過生物信息學計算預測的方法分析miRNA對管家基因和非管家基因的調控，結果發現不論單純基于多個軟件預測還是整合表達信息的方法都顯示出miRNA在管家基因和非管家基因上的調控存在明顯不同，具體表現為管家基因3'UTR區域miR-NA綁定的密度顯著高于非管家基因。在基于序列的靶位點識別中，分別將TargetScan、miRanda和RNAhybrid3個軟件各自的預測結果進行統計分析，發現不僅彼此之間的結果并不完全一致，而且各軟件的單獨預測結果也都同之前文獻報道中所采用PITA進行預測的結果不一致（Cheng等的工作發現miRNA對管家基因調控的數目顯著低于非管家基因，密度上沒有表現出明顯差異）,更加說明應用單一軟件識別靶位點的方法是不準確的，結果的可信性值得懷疑。本文整合多種軟件進行分析并引入表達信息提高了預測精度，Fold值的不斷改善也表明了該方法使得靶基因的預測結果趨于可靠，當然也有可能遺漏掉部分真正的miRNA靶基因。
由于管家基因和非管家基因在3'UTR長度上有明顯差異，考慮到長度不同對起調控作用的miRNA數目的影響，研究發現以單位位點上miRNA的調控數目作為評定指標更加合理。Stark等盡管也通過miRNA綁定密度來研究調控差異，但結果卻與我們的相反，主要是由于選取的背景基因不同，他們重點關注了部分基因，利用GO分支中屬于編碼核糖體蛋白的128個基因和神經元相關的364個基因來比較差異，并根據編碼核糖體蛋白的基因上miRNA綁定的密度顯著低于后者的結果來反映miRNA對管家基因和非管家基因的調控差異，容易導致以偏概全。我們則是將所有管家基因作為分析對象，避免以局部的結果來反映整體的調控水平。
考慮到miRNA的長度限制，將比較表達譜數據引入前后的預測結果可以看出miRNA的綁定密度指標得到改善，例如表1中HKmiRNA綁定密度為0.1936,在表3中降低到0.0079,這種結果更加符合miRNA在mRNA上的實際靶向情況。此外由于miRNA在動物中常結合于3'UTR區域，盡管管家基因的3'UTR在polyA尾去除前后均較短，理論上相對于非管家基因應該會逃逸miRNA的調控,之前的報道都傾向于這種結論，但我們的預測從另一個側面顯示了miRNA的調控對于管家基因的重要作用。同時我們還發現兩類基因在miRNA靶定密度上的差異與3'UTR的序列保守性具有一定的相關性，這種相關性的出現可能是源于生物不斷進化過程中管家基因需應對各種環境的改變，在多種約束條件下各組織中廣泛表達的基因要行使基本功能使得序列之間的分歧度減少，堿基更不容易發生變異，尤其是miRNA在對管家基因轉錄后水平的調節中雙鏈之間核心區域的匹配非常重要，若出現突變將失去這種調控作用，在協同進化過程中不能隨意突變保證了一部分miRNA對mRNA的調控。在3'UTR區域的進化分析中也看出管家基因中保守區域所占的比例較多，可見miRNA對管家基因的調控很必要，并且與3'UTR區域的保守性是相關的。更重要的是近幾年有關miRNA對基因表達調控的理論研究表明，miRNA對靶基因的負性調控作用同轉錄因子的轉錄調控相聯合，形成了具有特定拓撲結構的網絡模體，在增強靶基因表達穩健性的方面發揮魯棒性調控作用.綜上所述，我們的研究結果進一步突出了miRNA在管家基因調控中的重要性，提示其可能在維持管家基因表達的穩定性上起重要作用。
本研究反映出3'UTR區域的保守性與管家基因中miRNA調控密度較高具有相關性，但通過多種軟件預測所得到的結果以及表達譜的數據并不能直接表明兩者之間的因果關系，這一問題的解決還需要后續工作從基因進化和miRNA-靶基因相互作用的分子機制方面做進一步證明。同時由于真核基因表達調控的復雜性，僅從miRNA角度研究靶基因的表達調控作用是不完全的，還需聯合分析轉錄因子對表達水平的影響以及在維持基因表達的動態平衡中所發揮的調節作用，從而進一步揭示管家基因的調控機制。
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