枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是革蘭氏陽性細菌，是一種重要工業酶制劑的生產菌，中國農業部批準使用的安全菌株，現已廣泛應用于食品發酵行業.
在基因工程操作中，因為高拷貝外源質粒在B. subtilis中的穩定性較差，造成復制過程中大量單鏈脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid,DNA）的產生。單鏈DNA的積累，最終導致質粒的不穩定,質粒的不穩定性成為基因工程操作的最大障礙.因此，對于B. subtilis的基因改造主要是針對染色體基因組的改造，將外源基因整合到B. subtilis菌株染色體上.
在前期的研究中，實驗室已從貴州地區豆豉樣品中分離獲得可作為工業生產應用的菌株BJ3-2,但其谷氨酰胺酶活性較低。這就需要運用基因工程的方法對BJ3-2進行基因組改造，將高活性的glsA基因整合到BJ3-2中，形成新的工程菌株.考慮到BJ3-2應用于食品中的安全性問題，選擇可通過升溫消除的溫敏型質粒載體pKSV7.研究采用同源重組技術有效改良食品級安全基因組,為下一步將高活性谷氨酰胺酶基因定點整合入BJ3-2菌株獲得重組菌株提供了依據和理論基礎。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
菌株：Escherichia coli DH5α、B. subtilis BJ3-2為本實驗室保藏菌株。
質粒：pET28b為本實驗室保存；pKSV7為軍事醫學科學院饋贈。
Taq聚合酶、限制性內切酶、DNA Marker:日本TaKaRa公司；基因組提取試劑盒：北京Promega生物技術有限公司；質粒提取試劑盒：美國OMEGA生物技術公司；氯霉素：北京SOLARBIO科技有限公司；細菌谷氨酰胺酶檢測試劑盒：上海GENMED醫藥科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。
1.2 儀器與設備
MyCycler型PCR儀、Gel Doc XR型Universal Hood凝膠成像分析儀、165-2660型電穿孔系統（GenePulserXcell）：
美國Bio-Rad公司；Sonifier 450D型超聲破碎儀：美國BRANSON公司；SHZ-82型恒溫水浴鍋：江蘇金壇市醫療儀器廠；DHP-9162型電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；SKY-2102C型恒溫搖床：上海蘇坤實業有限公司；SW-CJ-IFD型標準型凈化工作臺：上海錦星科學儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 目的基因組文庫構建B. subtilis基因組DNA提取、質粒提取依照試劑盒說明書進行；DNA酶切、片段回收、連接采用常規方法。
1.3.2 引物設計根據美國國家生物技術信息中心（national center ofbiotechnology information,NCBI）上查詢得到的B. subtilis168菌株的基因組序列，定位glsA基因位置。截取glsA基因上游825bp片段作為上游同源臂Uarm;截取glsA基因下游902bp片段作為下游同源臂Darm;按pET28b載體上Kan基因序列設計引物；檢測引物（detection primer,DP）為同源臂的上下游204bp和137bp位置處?；驑嫿ǖ慕Y構見圖1,擴增基因名稱和引物序列見表1.【圖1.表1】
1.3.3 含Kan雙交換整合載體（pKUKD）的構建以pKSV7質粒為骨架，分別克隆入Uarm、Darm片段和Kan基因3個基因片段。Kan為重組菌株BJ-Kan抗性篩選標記，構建過程見圖2.【圖2】
由圖2可知，以B. subtilis BJ3-2基因組為模板，引物PUarmF/PUarmR和PDarmF/PDarmR擴增得到Uarm和Darm片段；以pET28b為模板，引物PkanF/PkanR擴增得到Kan基因.Hind III和Pst I對Uarm片段及pKSV7質粒進行雙酶切、連接，并轉化E. coli DH5α,獲得pKSV7-Uarm重組質粒.Pst I和BamH I對Kan基因及pKSV7-Uarm質粒進行雙酶切、連接，并轉化E. coli DH5α。獲得pKSV7-Uarm-Kan重組質粒.BamH I和Kpn I對Darm片段及pKSV7-Uarm-Kan質粒進行雙酶切、連接，并轉化E.coli DH5α。獲得pKSV7-Uarm-Kan-Darm即pKUKD重組質粒。
1.3.4 測序及比對pKUKD質粒構建完成后，送至英濰捷基公司測序。測序結果通過BLAST程序與B. subtilis 168菌株進行同源性比對，驗證構建序列是否正確.
1.3.5 同源重組介導glsA基因的敲除將pKUKD載體電轉化到BJ3-2菌株感受態中.
菌體涂布于Luria-Bertan（iLB）固體平板上（含卡那霉素2μg/mL），通過雙交換檢測引物pDPF/pDPR篩選重組菌株。
當glsA基因被Kan基因置換后，通過聚合酶鏈式反應（poly-merase chainreaction,PCR）擴增得到約3000bp大小的片段；而當Uarm或Darm發生單交換時，PCR擴增得到12 000bp片段.
將驗證后的陽性重組菌株45℃高溫傳代培養以丟失質粒，獲得重組菌株BJ-Kan.
1.3.6 重組菌株BJ-Kan的穩定性檢測將重組菌株BJ-Kan以0.1%的接種量接種至LB液體培養基中，連續傳代20次后進行PCR檢測。
1.3.7 重組菌株BJ-Kan及野生菌株BJ3-2的谷氨酰胺酶酶活測定將2種菌株在37℃、200r/min條件下振蕩培養過夜，在波長600nm條件下測量其光密度值，OD600nm相同時依照BACTERIUM GLUTAMINASE ASSAY KIT說明書進行檢測。
2 結果與分析
2.1 測序結果分析Uarm、Darm測序比對后發現，glsA基因上下游同源臂Uarm、Darm已正確連接，且與B. subtilis 168菌株同源性為99%,應為BJ3-2菌株上下游序列，可作為同源重組同源序列使用。
2.2 pKUKD載體轉化B. subtilis BJ3-2轉化子涂布氯霉素抗性平板，挑取單菌落，菌落PCR驗證pKUKD載體是否成功轉化至B. subtilis BJ3-2中。如圖3所示，菌落PCR能擴增glsA基因及Kan基因，證明轉化BJ3-2菌株中含有pKUKD質粒?！緢D3】
2.3 glsA基因敲除菌株的篩選與鑒定在所鑒定菌株中獲得1株pDPF/pDPR引物擴增篩選的陽性菌株，菌落PCR擴增結果見圖4.陽性菌株在3 000bp位置擴增出目的片段，且該菌株具有卡那霉素抗性.初步認定為glsA基因敲除菌株。將該陽性菌株接種于液體LB培養基，42℃高溫過夜培養后，進行菌落PCR檢測glsA基因及Kan基因。結果顯示，Kan基因能有效擴增，而glsA基因無擴增，且BJ-Kan菌株已喪失質粒所帶氯霉素抗性。證明該菌株為質粒已丟失的glsA敲除菌株?！緢D4】
2.4 重組菌株BJ-Kan及野生菌株BJ3-2的谷氨酰胺酶酶活測定相同條件下的BJ-Kan菌株及BJ3-2菌株谷氨酰胺酶酶活力檢測結果見表2.由表2可知，BJ3-2菌株及BJ-Kan菌株谷氨酰胺酶酶活力分別為26.8nmol（/min·mg）、6.4nmol（/min·mg），野生菌株BJ3-2酶活力較重組菌株BJ-Kan菌株高3.2倍，表明BJ-Kan菌株的glsA基因已被成功敲除?！颈?】
3 結論
通過卡那霉素抗性篩選獲得glsA基因敲除菌株BJ-Kan.證實了染色體上glsA基因可以通過所設計的上下游同源臂序列Uarm和Darm進行敲除、置換，為今后glsA基因的置換提供負篩選標記及理論基礎.通過重組菌株BJ-Kan與原菌株BJ3-2的谷氨酰胺酶活力對比可以看出，原菌株的谷氨酰胺酶酶活較重組菌株高出3.2倍。因此，在忽略其他影響因素的情況下可以認為，B. subtilis的谷氨酰胺酶酶活受谷氨酰胺酶基因的調控，同源重組完全可以用來改變BJ3-2谷氨酰胺酶活性。
在對BJ3-2基因進一步改造的研究中，可利用得到的glsA敲除菌株BJ-Kan以及重新構建的雙交換載體pKUGD（外源高活性谷氨酰胺酶基因載體），進行再次同源重組，從而獲得含高活性谷氨酰胺酶基因的BJ-GA工程菌株。該菌株由于不存在外源質粒，且沒有其他外源基因的插入（抗性基因），符合食品級改造的要求.因此，該菌株將可以用于食品（豆豉）發酵.
整合載體pKUKD的成功構建有利于外源高活性谷氨酰胺酶基因定點整合入B. subtilis染色體、在B. subtilis中穩定表達，為構建高表達效率的無抗性標記基因的工程菌奠定了重要的研究基礎.但由于B. subtilis同源重組中雙交換頻率較低，pKUKD載體轉化進入BJ3-2菌株后均可通過上游或下游同源臂與BJ3-2染色體形成單交換，從而導致雙交換重組菌株的篩選還較為困難.
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