線 粒 體 超 氧 化 物 歧 化 酶２（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ２）屬于金屬過氧化物歧化酶家族成員，是真核生物中的主要抗氧化酶，其在胞漿內合成，移至線粒體發揮作用，在清除細胞活性氧化物中起重要作用。有研究顯示：過氧化物和輻射等刺激能夠誘導ＳＯＤ２基因的表達，且ＳＯＤ２可 以 起 到 對 腫 瘤 細 胞 的 抑 制 作 用。研究表明：
ＳＯＤ２基因在細胞內過表達時能有效保護細胞免受氧化應激的損傷，而ＳＯＤ２基因缺失的小鼠可出現皮膚及免疫系統衰老的征象，提示其在細胞的抗氧化保護中起重要作用。研究發現：
ＳＯＤ２基因在人臍靜脈內皮細胞 （ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ＨＵＶＥＣ）中呈弱表達，本研究構建ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２重組質粒，觀察ＳＯＤ２基因在ＨＵＶＥＣ中的表達情況，并采用熒光定量ＰＣＲ方法檢測其差異性表達，旨在為ＳＯＤ２基因功能研究奠定基礎。
１材料與方法
１．１菌株、載體及細胞大腸桿菌 ＤＨ５α購于大連寶 生 物 工 程 有 限 公 司，ｐｃＤＮＡ３．０質 粒 購 于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＨＵＶＥＣ為吉林大學基礎醫學院病理生物學教育部重點實驗室保存。
１．２ 主要試劑 Ｐｆｕ高保 真ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ連 接 酶、ＡＭＶ逆 轉 錄 酶、Ｔｒｉｚｏｌ試 劑、ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ及ＤＮＡＭａｒｋｅｒλ－ＥｃｏＴ１４購自大連寶生物工程有限公司；ＥｃｏＲⅠ和Ｘｈｏ Ⅰ內切酶購自北京紐英倫生物技術有限公司；凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；質粒提取試劑購自Ｏｘｙｇｅｎ公司；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００購自ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）。
１．３引物設計根據ＮＣＢＩ關于人ＳＯＤ２編碼序列設計引物。為了定向克隆的方便，在上游引物和下游引物分別引入了ＥｃｏＲⅠ和Ｘｈｏ Ⅰ酶切位點，引物序列如下：
Ｆｏｒｗａｒｄ，５′－ＡＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＴ－ＧＴＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＣＧ－３′；Ｒｅｖｅｒｓｅ，５′－ＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＣＡＴＧＴ－ＡＴＣＴＴＴＣ－３′；隆片段為６８１ｂｐ。引物由上海生物工程公司合成。
１．４細胞培養ＨＵＶＥＣ用含１０ ％胎牛血清的ＩＭＤＭ培養基置于３７℃孵育箱中培養。
１．５細胞總 ＲＮＡ 提取應用Ｔｒｉｚｏｌ試劑按廠家說明書提取細胞總ＲＮＡ；用酶標儀于２６０和２８０ｎｍ波 長 處 測 定 吸 光 度 （Ａ）值，分 別 根 據Ａ２６０值及Ａ２６０／Ａ２８０比值確定ＲＮＡ濃度和純度，根據凝膠電泳確定ＲＮＡ樣品的完整性。
１．６逆轉錄 （ＲＴ）反應應用逆轉錄試劑盒按廠家說明書進行ＲＴ反應，合成第一股ｃＤＮＡ。
１．７ＰＣＲ 擴增獲取人 ＳＯＤ２ 編碼區應用ＰｆｕＤＮＡ聚合酶反應體系按廠家說明書對上述獲得的ｃＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增。擴增程序為：９４ ℃預變性２ｍｉｎ；９４℃變性３０ｓ，６２℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５個循環；７２ ℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ結束后每管?。郸蹋碳尤耄丁粒欤铮幔洌椋睿纾猓酰妫妫澹颍宝蹋?，混勻，上樣，１．５％瓊脂糖凝膠電泳檢測ＰＣＲ產物。用紫外凝膠成像儀對ＰＣＲ產物電泳條帶進行掃描照相。
１．８ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２重組質粒的構建按照凝膠回收試劑盒說明書，對ＲＴ－ＰＣＲ產物電泳的目的條帶進行回收?；厥盏模樱希模财闻cｐｃＤＮＡ３．０真核表達載體一起用ＥｃｏＲ Ⅰ和ＸｈｏⅠ雙酶切，Ｔ４連接酶連接，克隆至ｐｃＤＮＡ３．０載體中。連接體系如下：
１μＬＲＴ－ＰＣＲ產物，１μＬｐｃＤＮＡ３．０質粒，ｄｄＨ２Ｏ１９．５μＬ，混勻。４５℃、５ ｍｉｎ，冰上１ｍｉｎ，加入２．５μＬＤＮＡＬｉｇａｓｅＢｕｆｆｅｒ、１μＬＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ后，１６℃過夜連接。?。保埃唉蹋蹋模龋郸粮惺軕B細胞，加入５μＬ連接產物，混勻后冰?。常埃恚椋?，４２℃熱擊９０ｓ，冰?。玻恚椋?，加入９００μＬＬＢ培養基，３７℃溫和振蕩復蘇細胞１ｈ，?。保埃唉蹋剔D化產物涂布于含氨芐霉素的ＬＢ平板上，３７℃孵箱倒置培養２０ｈ，觀察菌落生長情況。
１．９菌落ＰＣＲ 鑒定重組陽性克?。玻郸蹋谭磻w系中 加 入ＰｆｕＴａｑＤＮＡ聚 合 酶ＭＩＸ混 合 物１２．５μＬ，上、下游引物各１μＬ，加滅菌雙蒸水至２５μＬ，用滅菌牙簽挑取單個圓滑菌落少許點入反應體系中。ＰＣＲ反應條件：９４ ℃預變性２ ｍｉｎ；９４℃變 性３０ｓ，６２ ℃退 火３０ｓ，７２ ℃延 伸１ｍｉｎ，３０個循環；７２℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ結束后每管?。郸蹋碳尤耄丁粒欤铮幔洌椋睿纾猓酰妫妫澹颍宝蹋?，混勻，上樣，１．５％瓊脂糖凝膠電泳檢測ＰＣＲ產物。用紫外凝膠成像儀對ＰＣＲ產物電泳條帶進行掃描照相。
１．１０ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２質粒雙酶切質粒提?。?br>?。校茫诣b定含有重組質粒的單一克隆，接種到含５０ｍｇ·Ｌ－１氨芐霉素的ＬＢ液體培養基中，３７℃、２２０ｒ·ｍｉｎ－１培養過夜。按照Ａｘｙｇｅｎ質粒提取試劑盒說明書進行質粒提取。將提取的ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２質粒進行ＥｃｏＲ Ⅰ和ＸｈｏⅠ雙酶切反應，?。郸蹋堂盖挟a物進行１％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察照相。
１．１１ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２序 列 測 定測 序 物 為ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２重 組 質 粒， 引 物 為 通 用 引 物ＰＣＤＮＡＴ７，測序結果與ＧｅｎＢａｎｋ中的ＳＯＤ２序列進行對比。
１．１２ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２重組質粒轉染 ＨＵＶＥＣ按照Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試 劑 轉 染 說 明 書 進 行２４孔板貼壁細胞的轉染。轉染后６ｈ換ＩＭＤＭ培養液，細胞繼續培養。
１．１３ＲＴ－ＰＣＲ 檢測轉染后 ＨＵＶＥＣ 中 ＳＯＤ２基因表達提取細胞總ＲＮＡ，進行ＲＴ－ＰＣＲ反應。ＰＣＲ產物經１．５％瓊脂糖凝膠電泳，照相分析。
２結果
２．１ＳＯＤ２編碼區 ＤＮＡ 片段的擴增從ＨＵＶＥＣ提取的總ＲＮＡ經鑒定其純度和完整性均 較好，ＲＴ－ＰＣＲ擴增產物凝膠電泳得到約６８１ｂｐ的ＤＮＡ條帶，即基因ＳＯＤ２編碼序列ＣＤＳ（６６９ｂｐ）加上兩端酶切位點的片段長度，與預期擴增片段大小相符 （圖１）。
２．２ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２表達載體的篩選應用對菌落的直接ＰＣＲ擴增法篩選陽性克隆，以菌落上的少許菌體直接作為模板進行ＰＣＲ擴增，經電泳分析發現：選取的５個菌落可見到６８１ｂｐ大小的陽性條帶 （圖２），與預期片段大小一致，推測此克隆即為含有ＳＯＤ２基因插入片段的陽性克隆。
２．３重組質粒ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２的雙酶切鑒定選取陽性克隆提取質粒ＤＮＡ，并進行ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切鑒定，結果見到６８１ｂｐ的條帶和載體片段 （圖３），此克隆為插入有ＳＯＤ２基因的重組質粒。
２．４表達載體的最終鑒定將構建的表達載體送上海英駿生物技術有限公司進行測序分析，測序的部分圖譜見圖４，結果表明測序反應完全可靠。ＤＮＡ測序結果見圖５，表達載體包含ＳＯＤ２全長編 碼 區 的６６９核 苷 酸 序 列， 與ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＭ－０００６３６）報道結果完全一致。
２．５轉染重組質粒的 ＨＵＶＥＣ中ＳＯＤ２的表達將重 組 質 粒ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２轉 染ＨＵＶＥＣ后，在３７℃、５％ ＣＯ２條件下培養２４ｈ，加入Ｇ４１８篩選 有 抗 性 的 克 隆 細 胞。 收 獲 轉 染 重 組 質 粒ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２的ＨＵＶＥＣ和空載對照組細胞，提取總ＲＮＡ，經過反轉錄得到ｃＤＮＡ，然后以其為模板進行ＰＣＲ擴增，電泳分析結果表明：與呈弱陽性條帶的對照組比較，轉染組細胞的目的條帶清晰可見。見圖６。
ＳＯＤ是機體內重要的抗氧化酶之一，能夠催化超氧化物通過歧化反應轉化為氧氣和過氧化氫。
在人和哺乳動物中，ＳＯＤ分為：
ＦｅＳＯＤ（ＳＯＤ１），存在于細胞內質網；ＭｎＳＯＤ（ＳＯＤ２），位于線粒體 中 ；ＣｕＺｎＳＯＤ（ＳＯＤ３），為 細 胞 外 基 質 超 氧 化物酶。ＳＯＤ２編碼的錳超氧化物歧化酶可以與氧化磷酸化作用的超氧化物副產物結合，從而將線粒體中產生的超氧離子清除，產生氧化能力相對較弱的過氧化氫。
ＨＵＶＥＣ是較易受到氧化損傷的一類細胞，在環境及藥物的持續刺激下，該細胞會呈現一定的 氧 化 損 傷 繼 而 發 生 凋 亡。本 研 究 發 現：
ＳＯＤ２在ＨＵＶＥＣ中 呈 弱 表 達。 超 氧 陰 離 子（Ｏ２－）、過氧化氫等活性氧能引發多種病理效應，導致 癌 癥、 過 敏、 動 脈 硬 化 和 老 年 癡 呆 等 疾病。 研 究發 現： 過 氧 化 物 和 超 氧 化 物（ＲＯＳ）等能夠誘導ＳＯＤ２基因的轉錄，從而使低濃度的活性氧自動被機體清除。當機體暴露于高水平的活性氧環境中時，由于線粒體中的ＤＮＡ無組蛋白的保護和有效的ＤＮＡ修復系統，因此很容易引起氧化損傷，并最終導致癌癥的發生。鑒于環境中輻射、氧化及生物體衰老等氧化應激反應的不可避免性，且機體正常情況下ＳＯＤ２表達相對ＳＯＤ１較低，在人體正常細胞，尤其易受到氧化損傷的內皮細胞過表達ＳＯＤ２便顯得尤為重要。對于ＳＯＤ基因的研究已經用于防輻射、防缺血再灌注、抗自身免疫性疾病、抑制腫瘤和癌癥等方面。
對于ＳＯＤ２基因研究的生物學效應也很廣泛，但ＳＯＤ２基因在抗氧化及抗腫瘤中的具體作用途徑及機制尚有待進一步探討。隨著人們對氧化應激機制研究的不斷探索，ＳＯＤ２基因也日益廣泛地受到關注。本實驗克隆了ＳＯＤ２ＤＮＡ編碼區序列，構建了ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２真核表達載體，并能在真核細胞中過表達，本研究結果為進一步的體內研究及基因治療創造了條件，為研究ＳＯＤ２在氧化應激相關疾病發生發展中的作用奠定了基礎。
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