轉基因技術的問世給世界帶來了經濟、社會、生態等多方面的效益，成為新一代綠色革命的利器，是農業近代史上發展最快的新技術。國際農業生物技術應用服務組織\\( International Servicefor the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA\\) 2013 年報告指出，全球有 27 個國家種植了轉基因作物，種植面積比 2012 年增加了 500 萬hm2。自 1996 年種植以來的 18 年間，從最初的170 萬 hm2增加到 1． 75 億 hm2，增長速度驚人。
可見，轉基因技術的發展呈現不可阻擋的趨勢。
但隨著該技術的發展，其安全性問題備受矚目，其中花粉介導的基因飄流及其可能引起的環境后果是人們關注的焦點之一。研究者們為降低轉基因向其他物種的飄流做過許多嘗試，包括物理隔離和眾多生物學措施，各種措施因物種和基因本身等性質有其各自的優缺點，目前尚未明確哪種措施最簡單有效，且具有通用性。
基因拆分技術是建立在內含肽 intein 及其介導的蛋白質剪接的基礎上發展起來的，將目的基因拆分成兩個片段，分別與 intein 兩個剪接域的基因序列結合，形成融合基因，翻譯后形成的兩個融合蛋白通過 intein 介導的蛋白質剪接功能，將intein 從前體蛋白中切除，同時將兩個基因片段編碼的蛋白質序列連接起來，形成一個完整的、有功能的蛋白質?；虿鸱旨夹g的提出為通過生物學措施控制轉基因飄流提供了新的思路和途徑。

1 基因拆分技術的理論基礎

1． 1 Intein 的概念及分類

內含肽 intein 是存在于蛋白質前體中的一段氨基酸序列，與兩側的外顯肽\\( extein\\) 存在于同一個表達框中，同時表達成前體蛋白，在前體蛋白成熟的過程中，intein 通過自剪接的方式將自身從中切除出去，同時將兩端的外顯肽以肽鍵的形式連接起來，該過程也被稱為蛋白質的自我剪接。與 ＲNA 內含子\\( intron\\) 類似，蛋白質內含肽屬于可以移動的遺傳元件，內含肽的剪接反應發生于蛋白質水平，而且反應過程不需要任何輔助因子的參與\\( 圖 1\\)。
1990 年，intein 首次在研究釀酒酵母液泡H+-ATPase 基因 TGPl 時被發現。其后的 20幾年里，intein 的研究和應用發展非常迅速。截至2010 年，在 Inbase 數據庫中注冊的內含肽達 585 個，其中112 個在真核生物中，290 個在細菌中，另外 183個屬于古細菌。目前僅在單細胞真核生物中發現intein，而在高等動、植物，甚至低等多細胞真核生物中都沒有發現內含肽的存在。
關于內含肽的分類有很多說法，常見的是根據內含肽中間結構域的類型將內含肽分為經典內含肽、微小內含肽和斷裂內含肽。經典內含肽的中間結構域為歸巢核酸內切酶結構域，微小內含肽的中間結構域僅為一個連接結構域，而斷裂內含肽在中間結構域的特定位點斷開，在基因組中不同的位置獨立表達。經典內含肽與微小內含肽的中間結構域有共價連接，因此也叫做順式剪接內含肽\\( cis-splicing intein\\) ; 斷裂內含肽的中間結構域無共價鍵連接，也叫做反式剪接內含肽\\( trans-splicing intein\\) 。Ssp DnaE 內含肽\\( Syne-chocystis sp． PCC6803 DnaE intein\\) 是發現的第一個天然存在的斷裂內含肽，存在于編碼 DNA 聚合酶Ⅲ的催化亞基 α 的 DnaE 基因中，包括 123 個氨基酸殘基的 In \\( Intein N 端\\) 和 36 個氨基酸殘基的 Ic \\( Intein C 端\\) 兩個結構域，In 和 Ic 在基因組上相距 745 kb。與人工合成的 intein 相比，DnaE intein 催化的蛋白質剪接具有反應效率高和反應條件溫和等特點。實驗證明 Ssp DnaEintein 在離體、活體條件下均能進行蛋白質的剪接反應，使分開的兩個基因片段表達后的蛋白質片段重新組裝成有功能的完整蛋白質。
眾多研究證明，內含肽的自我剪接并不依賴于其兩側外顯肽的種類，也就是說，當外顯肽被外源蛋白質替換掉時，該剪接作用依然可以發生。同時，內含肽自剪接反應是自發進行的，甚至可以在體外進行。這給利用intein 進行更多的蛋白質工程和植物基因工程研究提供了嶄新的思路。

1． 2 Intein 的剪接機制

根據內含肽的保守性及其特點，多數內含肽被分為10 個模塊，從 N 端到 C 端依次是存在于 N端的 A、N2、B 和 N4，位于核酸內切酶結構域的C、D、E 和 H，以及位于 C 端的 F 和 G。經研究，普遍認為 A、B、F 和 G 是 intein 維持結構或進行剪接反應所必需的。在對眾多 intein 的保守性氨基酸的研究中發現，有 4 個高度保守的位點對intein 剪接功能有重要作用，包括: A ∶ 1 位置的Ser、Thr 或 Cys; G 末端的 Asn; C-extein 的第一氨基酸 Ser、Thr 或 Cys，以及 intein 的倒數第二個氨基酸 His。后來的研究也認為 B∶ 10 位的 His對剪接過程也有很重要的影響。目前對內含肽的剪接機制已經研究的非常透徹，普遍認為內含肽的自我剪接分為四個階段，分別是:
①N-X?；D移反應\\( X 代表 O 原子或 S 原子，后同\\) : 這是第一個?；D移反應，A∶ 1 位的 S 或 O原子攻擊其上游肽鍵的 C 原子，使 N 端的外顯肽轉移到 N 端剪接域的 Ser 氧原子或 Cys 硫原子上，形成帶有酯鍵或硫酯鍵的中間產物。大多數intein N 端的第一個氨基酸殘基為 Cys 或 Ser。②轉酯反應: C 端剪接域的親核殘基攻擊 N 端在第一步形成的酯鍵或硫酯鍵，進行轉酯反應，至此，N-extein 轉移到 C 端剪接域的 Ser\\( Thr\\) 的 O 原子或 Cys 的 S 原子上，C 端剪接域的第一個氨基酸殘基可以是 Cys、Ser 或 Thr。③Asn 環化反應: C端剪接域的 Asn 環化使內含肽與 C-extein 之間發生斷裂，將內含肽剪切下來。④X-N ?；D移反應: 這是第二個?；D移反應，通過酯鍵或硫酯鍵連接的兩個 extein 經過重排形成肽鍵，內含肽脫離，形成成熟蛋白質。

1． 3 Intein 衍生的新技術

內含肽的發現和研究給蛋白質工程研究提供了眾多便利條件。利用內含肽的剪接作用，可以進 行 蛋 白 質 的 純 化、表 達 蛋 白 的 連 接\\( EPL\\)、蛋白質的環化、毒蛋白的大量合成，以及多聚體蛋白合成等。在人們廣泛關注的轉基因安全問題中更是具有巨大的潛力。利用基因拆分技術將外源基因在植物體內拆分表達后再組裝成有功能的蛋白，在很大程度上限制了該基因向近緣物種的飄流，基因拆分技術的研究很可能為安全轉基因提供強大的技術支撐。

2 基因拆分技術在限控轉基因飄流中的應用

斷裂內含肽的發現為利用基因拆分技術限控轉基因飄流提供了有用的工具。但基因拆分技術能否作為一項有效措施用于限控轉基因飄流，這取決于基因拆分后在植物體內重新組裝成有功能蛋白質的效率及限控轉基因飄流的效果。

2． 1 基因拆分后在植物體內的重新組裝效率

Chin 等把耐除草劑基因 epsps 分成 N 端和C 端兩部分，N 端與葉綠體定位信號和 Ssp DnaEintein 的 In 融合形成 EPSPSn-In，并通過農桿菌介導法將 EPSPSn-In 整合到煙草核基因組中; C端與 Ssp DnaE intein 的 Ic 融合形成 Ic-EPSPSc，利用基因槍法將 Ic-EPSPSc 整合到含有 EPSPSn-In 煙草的葉綠體基因組中。結果同時含有 EP-SPSn-In 和 Ic-EPSPSc 的轉基因煙草表現出了抗草甘膦的特性，證明了 intein 介導的蛋白轉剪接可以在植物葉綠體中發生。Yang 等將 β-葡糖醛酸苷酶基因 gus 的 N 端和 C 端分別與 Ssp DnaEIntein 的 In 和 Ic 連接形成融合基因 GUSn / In 和Ic / GUSc，利用共轉化或有性雜交的方法將 GUSn / In和 Ic/GUSc 導入到擬南芥基因組中，同時含有兩個基因片段的轉基因擬南芥成功表達了 GUS 活性。
Gils 等利用 intein 介導的 Barnase 蛋白重新組裝系統創立了一種全新的制備小麥雄性不育系的方法，首次通過雜交使雜交種中同時含有 N、C 兩個片段，并得到產生不可育花粉的植株。2009 年，Kempe 等也在小麥中證實 intein 可在小麥中恢復拆分后的 Barnase 基因的功能，說明intein 介導的蛋白轉剪接不僅在模式植物中，在單子葉植物中同樣也能發揮功能?？共莞熟⒌?G2-aroA 在 F295 / S296 位點拆分后，能夠在 intein 介導的轉剪接作用下組裝成有活性的功能蛋白。
靳茜等根據 G2-aroA 基因的可拆分位點 F295/T296，利用 PCＲ 方法將 G2-aroA 基因分成 N 端和C 端兩部分，并分別與 Ssp DnaE intein 的 N 端和C 端連接，形成融合基因片段 EnIn 和 IcEc，通過農桿菌介導法分別導入煙草核基因組中，通過雜交獲得同時含有 2 個片段的轉基因煙草，證明G2-aroA 基因拆分后在煙草葉綠體中重新組裝成完整有功能的蛋白的效率可達到 100%。

2． 2 基因拆分技術限控轉基因飄流的效果

基因拆分技術用于限控基因飄流的優勢是它降低了目標基因從轉基因植株向近緣野生種飄移的概率\\( 圖 2\\) 。理論上，基因拆分技術限控轉基因飄流的效果與兩個基因片段的插入位點密切相關。根據孟德爾遺傳規律，假如拆分后的兩個基因片段插入到轉基因植物的非同源染色體上，雜交后代產生的花粉中有 25% 同時含有兩個基因片段; 當兩個基因片段插入到同源染色體上時，如果不考慮染色體交換，雜交后代的花粉中同時含有兩個基因片段的概率為0。靳茜等通過有性雜交的方法獲得同時含有 EPSPSn-In 或 Ic-EPSPSc 的轉基因煙草，自交試驗證明了兩個基因片段插入在非同源染色體上，回交試驗結果表明后代中有 23． 61% 的植株具有草甘膦抗性，與兩個基因片段插入非同源染色體上時 25% 為抗性苗的假設相符，證明了利用基因拆分技術培育的轉基因植物中，其外源基因向有性雜交種的基因飄流頻率至少能夠降低 75%。

3 問題與展望

糧食發展的目標不僅要讓人們吃得飽，還要吃得好、吃的安全，這為轉基因技術在糧食作物上的應用提供了良好的契機，同時也讓轉基因技術承受了巨大的挑戰，如何趨利避害，提供安全的、環境友好的轉基因方案是當今生物科學界不得不面對的問題。
為了從根本上杜絕基因飄流，保障轉基因產品的環境和食品安全，研究者們提出了一系列生物學措施來控制轉基因飄流，包括葉綠體轉化、可控轉基因技術、閉花受精、基因刪除、轉基因削弱和雄性不育等。但每種措施都有其自身的特點和使用范圍。如葉綠體為母系遺傳，利用葉綠體轉化培育的轉基因植物，其基因飄流的風險大大降低，但有些植物的葉綠體不是母系遺傳，而且葉綠體轉化時同質化很困難，這都制約了葉綠體轉化的應用。雄性不育能有效地控制父本的轉基因飄流，但仍能作為母本與其有性可交配種雜交而產生轉基因雜交種。轉基因弱化技術能控制基因向雜草的飄流，但不能限制轉基因向同物種的飄流。2010 年，Hüsken 等對這些措施各自的優缺點和當前的研究進展進行了詳細的綜述，并指出沒有哪種措施能夠百分百地控制轉基因飄流，只有多種措施結合使用才能獲得理想的限控轉基因飄流的效果。
基因拆分技術為限控轉基因飄流上提供了新的思路。如上所述，已有包括 gus、G2-aroA、和 ALSⅡ等基因在內的多個基因拆分后利用此技術在擬南芥、煙草和小麥等植物中恢復目標蛋白功能，而且在煙草中也明確了基因拆分后在植株水平上的重新組裝效率可高達 100%，能降低至少 75% 的轉基因飄流頻率，因此，基因拆分技術可能具有很好的通用性。而且通過篩選，獲得拆分后的基因片段位于同源染色體的轉化體，就有可能完全控制轉基因植株的基因飄流。但基因拆分技術的普遍應用，還需要解決以下兩個問題: 一是基因有效可拆分位點的篩選，二是建立從分子水平上明確基因拆分后的重新組裝效率的技術。相信隨著分子生物學的發展，相關新方法、新技術的涌現，基因拆分技術在防控轉基因飄流中會擁有廣闊的應用前景，并將進一步促進轉基因產品的商業化進程。

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