原標題:二化螟的水稻種群和茭白種群對殺蟲劑和Cry蛋白的敏感性比較
摘要:采用微量點滴法測定了二化螟的水稻和茭白種群幼蟲對殺蟲劑辛硫磷、毒死蜱、氯蟲苯甲酰胺、殺蟲單和阿維菌素的敏感性,采用人工飼料胃毒法測定了二化螟對Cry蛋白\\(Cry1Ac、Cry2Aa、Cry1Ca\\)的敏感性,目的是為二化螟科學防治和抗性治理提供理論基礎。結果表明:二化螟兩寄主種群對阿維菌素和氯蟲苯甲酰胺的敏感性差異顯著,但對其他3種藥劑及Cry蛋白的敏感性差異不顯著。水稻種群和茭白種群對5種殺蟲劑的敏感性由高到低均為阿維菌素>氯蟲苯甲酰胺>辛硫磷>毒死蜱>殺蟲單;對3種Cry蛋白的敏感性由高到低為Cry1Ca>Cry1Ac>Cry2Aa。因此,針對不同寄主田的二化螟種群應采用不同類型的藥劑,盡量不使用單一藥劑,可考慮采用藥效最好的阿維菌素與其他幾種藥劑進行混配施用。
關鍵詞:二化螟;寄主種群;殺蟲劑;Cry蛋白;敏感性

二化螟\\(Chilosuppressalis\\)是一種重要的農業害蟲,寄主范圍廣,其中包括禾本科的水稻\\(Oryzasativa\\)和茭白\\(Zizanialatifolia\\)。研究表明,來源于水稻田和茭白田的二化螟種群在生理、生態、形態及行為等方面存在差異,表現出部分生殖隔離,有學者將其分為水稻種群和茭白種群[1-4]。二化螟兩種群危害水稻和茭白后,嚴重影響水稻和茭白的產量及質量,造成重大經濟損失。因此,對二化螟進行有效的防控在農作物保護和生產活動中顯得尤為重要。

化學防治是控制二化螟的有效措施之一。然而,長期不合理使用化學殺蟲劑導致二化螟對多種藥劑產生抗藥性。1962年,日本學者報道了二化螟對有機磷藥劑存在抗藥性[5];近年來,國內外陸續報道了二化螟對有機磷類、沙蠶毒素、氨基甲酸酯類、阿維菌素等殺蟲劑產生抗藥性[6-7];可見,二化螟對殺蟲劑產生抗藥性的速度呈上升趨勢。為有效地控制害蟲的危害,并減緩其產生抗藥性的速度,轉基因技術等新型的害蟲防治手段發展迅速,并逐漸應用于實際生產中害蟲綜合防治。

目前,轉基因抗蟲水稻已通過田間試驗,國內已有轉基因水稻品種獲得安全認證。雖然轉基因抗蟲水稻在害蟲治理上提供了新思路,但是與二化螟對化學藥劑產生抗藥性一樣,二化螟對轉Bt基因水稻產生抗藥性的風險也受到廣泛關注。研究表明,二化螟對不同的Bt殺蟲蛋白\\(Cry蛋白\\)如Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1Ca等的敏感性存在差異[8-9]。當田間選擇壓力在50%~90%時,二化螟對Cry1Ac的耐受性提高10倍需58~133代,對Cry1Ab的耐受性提高10倍需14~32代[10]。由此推測,在大面積商業化種植轉Bt水稻長期后,二化螟對Bt殺蟲蛋白存在產生抗藥性風險的可能。

昆蟲取食不同寄主后,其對外源有毒物質的敏感性存在差異。早期的研究發現,二化螟水稻種群對有機磷殺蟲劑的敏感性顯著低于二化螟茭白種群[2]。研究兩寄主種群對其他化學藥劑和Cry蛋白的敏感性是否也存在差異對有效治理不同寄主田二化螟種群和延緩其抗藥性意義重大。因此,本研究以二化螟水稻種群和茭白種群為對象,探究兩寄主種群對3種Cry蛋白及5種常用化學藥劑的敏感性差異,為不同寄主田防治二化螟時的藥劑選擇提供依據,并為二化螟抗藥性治理提供一定的參考。

1材料與方法

1.1供試蟲源

二化螟水稻種群2010年7月采集于武漢市蔡甸區水稻田\\(113°57′E,30°29′N\\),茭白種群2010年5月采集于武漢蔬菜所水生蔬菜張家灣實驗基地茭白田\\(114°16′E,30°28′N\\)。室內實驗證實采集到的兩種群交配節律存在顯著差異\\(未發表數據\\),而交配節律的差異是鑒定二化螟寄主種群的關鍵因素[3]。

兩種群于養蟲室內\\(溫度\\(28±1\\)℃,相對濕度70%~80%,光周期L15∶D9\\)分別以主成分為水稻稈和茭白果肉的兩種人工飼料飼養3代后,取第4代初孵幼蟲和4齡幼蟲用于后續實驗。

1.2供試藥劑

供試藥劑見表1。

1.3實驗方法

1.3.1二化螟水稻種群和茭白種群4齡幼蟲對5種殺蟲劑的敏感性采用微量點滴法[11]分別測試兩寄主種群4齡幼蟲對5種殺蟲劑的敏感性。以95%丙酮\\(殺蟲單用V丙酮∶V水=1∶1的溶液\\)為溶劑,供測藥劑設置5~7個濃度梯度。使用微量進樣器\\(上海申安醫療器械廠所制,容積為1μL\\)吸取0.06μL藥液點滴在二化螟幼蟲的前胸背板上。每處理10頭試蟲,重復3次,設置丙酮或丙酮/水混合液為對照。藥劑處理后將幼蟲轉移至上述飼養環境中飼養。

48h后統計毒死蜱、辛硫磷和氯蟲苯甲酰胺處理組的幼蟲死亡數,判別標準為針刺幼蟲無自主性反應或幼蟲身體變黑;96h后統計阿維菌素和殺蟲單處理組的幼蟲死亡數,判別標準為蟲體發軟或翻身后30s內不能翻轉[10]。

1.3.2二化螟水稻種群和茭白種群初孵幼蟲對Cry蛋白的敏感性采用人工飼料胃毒法[9]測試兩種群初孵幼蟲對Cry蛋白的敏感性。將Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca干粉分別用碳酸鈉溶液\\(pH10.0\\)溶解后混勻制成母液。以蒸餾水作為溶劑,供試藥劑均設5個濃度梯度,并分別與人工飼料充分混合均勻,置于10mL的離心管中。每管挑取10頭初孵幼蟲,重復4次。

以未添加Cry蛋白的人工飼料作為對照,6d后統計幼蟲的死亡率,針刺無自主性反應時認為是死亡個體[9]。

1.4數據分析

采用MicrosoftExcel軟件計算校正死亡率、毒力回歸方程以及LD50\\(LC50\\)95%置信區間等有關參數。以LD50\\(LC50\\)的95%置信限是否有重疊作為判斷不同種群間藥劑敏感度及同一種群對不同藥劑敏感度差異是否顯著的標準[8]。以毒力回歸方程中的斜率作為判斷種群同質性的依據。供試群體對藥劑毒力回歸線的b值越小,供試群體的異質性越大[8],即對該藥的毒力反應個體之間差異較大,該供試群體對藥劑產生抗藥性越容易。相對毒力指數=[標準藥劑LD50\\(LC50\\)×100/供試藥劑LD50\\(LC50\\)]。

2結果與分析

2.1二化螟水稻種群和茭白種群

4齡幼蟲對不同類型殺蟲劑的敏感性通過比較兩種群4齡幼蟲對同一藥劑的毒力回歸方程斜率大小可知,水稻種群對毒死蜱和阿維菌素的異質性高于茭白種群,而對辛硫磷、氯蟲苯甲酰胺和殺蟲單的異質性低于茭白種群,說明水稻種群更容易對毒死蜱和阿維菌素這2種藥劑產生抗藥性;而茭白種群更容易對辛硫磷、氯蟲苯甲酰胺和殺蟲單這3種藥劑產生抗藥性\\(表2\\)。

兩種群4齡幼蟲對同一藥劑的致死中量及其置信區間的實驗結果表明:二化螟水稻種群4齡幼蟲對氯蟲苯甲酰胺和阿維菌素的敏感性顯著低于茭白種群;對辛硫磷和毒死蜱的敏感性比茭白種群低,但差異不顯著;二化螟水稻種群對殺蟲單的敏感性比茭白種群高,差異未達到顯著水平\\(表2\\)。

另外,本研究中,同一寄主種群二化螟4齡幼蟲對幾種類型殺蟲劑的致死中量的置信區間均不重疊,且對不同藥劑毒力回歸線的b值均不同\\(表2\\),說明二化螟對不同殺蟲劑的敏感性存在顯著差異,對不同殺蟲劑產生抗藥性難易程度存在差異。水稻種群和茭白種群對不同殺蟲劑的敏感性由大到小的次序均為:阿維菌素>氯蟲苯甲酰胺>辛硫磷>毒死蜱>殺蟲單。水稻種群對幾種藥劑產生抗藥性由易到難順序為:毒死蜱、阿維菌素、殺蟲單、氯蟲苯甲酰胺、辛硫磷;茭白種群對幾種藥劑產生抗藥性由易到難順序為:殺蟲單、阿維菌素、氯蟲苯甲酰胺、毒死蜱、辛硫磷。

2.2二化螟水稻種群和茭白種群初孵幼蟲對Cry蛋白的敏感性表3為二化螟初孵幼蟲對不同Cry蛋白的敏感性比較。通過比較兩種群初孵幼蟲對同一毒蛋白的毒力回歸方程斜率大小可知,水稻種群初孵幼蟲對Cry1Ac和Cry1Ca的異質性比茭白種群高,而對Cry2Aa的異質性比茭白種群低,說明水稻種群對Cry1Ac和Cry1Ca更容易產生抗藥性,而茭白種群對Cry2Aa更容易產生抗藥性。

兩種群對同一藥劑的致死中濃度及其置信區間的結果表明,水稻種群對Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca的敏感性與茭白種群有差異,但差異均不顯著。同一寄主種群二化螟初孵幼蟲對幾種Cry蛋白的致死中濃度的置信區間均不重疊,且對不同Cry蛋白毒力回歸線的b值均不同\\(表3\\),表明二化螟對不同Cry蛋白的敏感性存在顯著差異,且對不同Cry蛋白產生抗性的難易程度存在差異\\(表2\\)。二化螟水稻種群和茭白種群對3種殺蟲蛋白的敏感性由強到弱的順序為:Cry1Ca>Cry1Ac>Cry2Aa;二化螟水稻種群和茭白種群對3種Cry蛋白產生抗藥性由易到難順序為:Cry1Ca、Cry1Ac、Cry2Aa。

3討論

本研究表明,二化螟水稻種群和茭白種群對所測幾種類型殺蟲劑敏感性存在差異,且對同一藥劑產生抗藥性的難易程度也存在差異。因此,針對不同寄主田的二化螟種群應采用不同類型的藥劑。相對于水稻田,茭白田二化螟種群適宜用較低含量的阿維菌素和氯蟲苯甲酰胺來進行防治,可減少施藥以達到防止農藥過量以及減緩抗性發展的目的。另外,本研究表明,二化螟對不同類型藥劑的敏感性存在顯著差異,且對不同藥劑產生抗藥性的難易程度也存在差異。據此,田間防治二化螟時應盡量不使用單一藥劑,可考慮采用藥效最好的阿維菌素與其他幾種藥劑進行混配施用,既有增效作用,又能延緩二化螟對藥劑產生抗藥性的速度,延長殺蟲劑的使用壽命。

二化螟水稻種群和茭白種群對同種殺蟲劑的敏感性差異,可能是由于:

1\\)不同類型殺蟲劑作用機理有差異;2\\)不同寄主植物對害蟲抗藥能力的誘導效果不同;3\\)兩寄主種群酯酶同工酶存在差異,存在種下分化的可能。昆蟲對殺蟲劑敏感性變化與殺蟲劑的作用機制存在一定關系。本研究證明二化螟寄主種群對阿維菌素和氯蟲苯甲酰胺的敏感性存在顯著差異,這可能是由于兩種藥劑的獨特作用方式。阿維菌素是一種神經毒素,作用靶標為昆蟲的γ-氨基丁酸受體\\(GABAR\\),也可作用于抑制性谷氨酸受體\\(IGluR\\),改變氯離子通道[12-13];而氯蟲苯甲酰胺與魚尼汀受體\\(RyRs\\)結合,高效激活昆蟲魚尼汀受體后,過度釋放細胞內庫中的鈣離子[14],寄主植物可能引起相關受體的變化從而導致差異的產生。昆蟲取食不同植物后對殺蟲劑的敏感性會發生變化,這種現象已有報道[15-17]。昆蟲對殺蟲劑敏感性變化與寄主植物次生物質對昆蟲體內解毒酶活性的誘導激活或抑制有關,誘導可能受到次生物質種類、含量、環境以及植物營養等影響,經過誘導,害蟲的解毒酶對殺蟲劑的代謝能力會發生變化[18-20],從而導致同種昆蟲取食不同寄主后對同一藥劑的敏感性產生差異。此外,前人研究二化螟對氧化殺螟松、殺螟硫磷等藥劑的抗藥性時,發現其抗藥性機理與酯酶同工酶有關[2],而酯酶同工酶是昆蟲分類的重要參考指標[21],二化螟水稻種群和茭白種群的酯酶同工酶存在差異[2]。因此,二化螟不同寄主種群藥劑敏感性差異可能與二化螟存在種下分化有關,其內在機制有待進一步研究。

二化螟同一種群對不同Cry蛋白敏感性存在顯著差異,對Cry1Ca的敏感性最高,Cry1Ac次之,Cry2Aa的敏感性最低。其原因可能是Cry1Ca、Cry1Ac和Cry2Aa的作用靶標位點存在差異,即其毒理機制存在一定差異[22-23]。因此,未來轉基因水稻商業化種植時,可考慮研發雙價或多價轉基因水稻,獲得更好的殺蟲效果,起到延緩二化螟對Cry蛋白產生抗藥性速度。

二化螟水稻種群對Cry蛋白敏感性和茭白種群相比存在一定差異。水稻種群對Cry1Ac和Cry1Ca更容易產生抗藥性,茭白種群對Cry2Aa更容易產生抗藥性。利用這一現象,在特定品種轉基因水稻商業化種植時,茭白田可作為水稻田邊二化螟的“庇護所”,從而起到減緩二化螟對Cry蛋白產生抗藥性的速度,這一策略已在其他轉基因作物中應用[24-25]。