摘要 目的：檢測通用轉錄因子3（BTF3）在卵巢癌生長增殖中的作用，探討其作為治療靶點的可行性。方法：構建shBTF3慢病毒載體后轉染人卵巢癌SKOV3細胞，采用細胞成像儀檢測細胞生長狀況，流式細胞術檢測細胞周期及凋亡率，MTT法檢測慢病毒轉染后SKOV3細胞增殖狀態的改變。結果：shBTF3慢病毒載體成功轉染SK-OV3細胞后，與對照組相比，實驗組細胞生長狀況下降，增殖減慢。SKOV3細胞周期G1期被抑制，細胞凋亡率升高（P<0.05）。結論：BTF3對卵巢癌細胞SKOV3的生長增殖具有促進作用，考慮BTF3基因在卵巢癌中的表達可能與其發生發展及分級分期密切相關。
關鍵詞 卵巢癌；通用轉錄因子3;慢病毒；細胞增殖。
卵巢癌由于缺乏早期診斷指標，浸潤轉移早，化療敏感性較低，一直高居婦科惡性腫瘤病死率之首，盡管經過了積極而徹底的腫瘤細胞減滅術和聯合化療的應用，患者的5年生存率仍低于40%[1].目前，導致卵巢癌生物學行為的分子機制尚不清楚，但是腫瘤細胞的惡性增殖是絕大部分腫瘤細胞惡性生物學行為的關鍵步驟。故而，探索卵巢癌早期診斷的分子標記物，尤其是與腫瘤細胞生長增殖及凋亡相關的分子標記物，成為了現如今卵巢癌治療中亟待解決的問題。隨著基因組學與蛋白質組學研究的逐漸深入，現已發現諸多新型的可用于卵巢癌診斷的分子標記物，轉錄因子即是其中的一類蛋白。有研究表明，轉錄因子的藥理和基因組調節可能被用于生殖過程的控制和治療卵巢疾病?；诖擞斜匾芯炕巨D錄因子與卵巢癌細胞的關系。
通用轉錄因子3（basic transcription factor 3,BTF3）為普遍性轉錄因子中的一員，能夠與RNA聚合酶Ⅱ相結合，作為基因轉錄起始復合的一部分。大多數關于BTF3的研究主要圍繞生物體或植物，認為BTF3能夠導致煙草葉片發黃、形態異常[2],影響小麥的生存率[3].進一步的研究發現，BTF3除了與基因的轉錄調控密切相關，同時在諸多細胞中參與細胞凋亡的進程，并且對于細胞的生長發育和形態建成均有影響[4].現如今，越來越多的研究發現BTF3在腫瘤細胞中起著抗凋亡的作用，然而這些研究多局限于消化系統或神經內分泌系統腫瘤[5-8],對BTF3與其他基因或信號通路的相互作用機制仍不清楚。故而，本研究構建了shBTF3慢病毒轉染人卵巢癌SKOV3細胞，通過研究BTF3對SKOV3細胞增殖、凋亡的影響，進一步探索其在卵巢癌生長增殖中的意義。
1材料與方法
1.1材料DMEM高糖培養基（美國Gibco）；卵巢癌細胞系SKOV3為本實驗室保存；Trizol購自于上海普飛公司；RNA逆轉錄使用Promega M-MLV試劑盒；逆轉錄引物、MicroRNA PCR引物購自廣州市銳博生物科技有限公 司；GV115載 體，AgeⅠ/EcoRⅠ酶切，購自上海吉凱基因化學技術有限公司；質粒抽提試劑盒購于Qiangen公司。
1.2 SKOV3細胞培養與傳代復蘇的SKOV3細胞系使用10%FBS完全培養基培養，置于37℃5%CO2恒溫培養箱中培養，待細胞80%-90%融合時，傳代培養。
1.3 BTF3慢病毒載體的轉染與表達獲取BTF3序列后，通過載體酶切、目的基因擴增、構建重組質粒，隨后將測序結果對比正確的克隆進行質粒抽提。
利用限制性內切酶消化獲得線性化載體。以線性化載體和退火產物配制反應體系，將線性載體與設計引物進行連接反應，產物直接進行轉化。將正確克隆菌液擴大培養、抽提用于下游病毒包裝。將攜帶目的基因或靶點序列的工具載體質粒GV115、病毒包裝輔助質粒（Helper 1.0）、病毒包裝輔助質粒（Helper 2.0）共轉染293T細胞，在轉染完成后的48-72h收取未純化的細胞上清液，采用相應的濃縮純化方式得到高滴度的慢病毒保存液，并測定慢病毒滴度。按照預實驗確定的感染條件，使用感染液將SKOV3細胞制成 （3-5）×105個/ml懸液，待培養細胞融合度達30%時，加入最適病毒量感染，8-12h后觀察細胞性狀，更換培養基后繼續培養。感染后72h左右，熒光顯微鏡下觀察報告基因GFP的表達情況，熒光率大于80%即為陽性感染率。
實驗分組為陰性對照病毒感染 （shCtrl）組和shBTF3病毒感染組。各組分別用Trizol RNA提取各組細胞總RNA,用RT-PCR檢測各組細胞內BTF3表達程度，評價轉染的可靠性。
1.4 Celigo細胞成像儀檢測細胞生長狀態將各組細胞以1 000個細胞/孔種入96孔板進行培養，從鋪板后第2天開始，每天Celigo檢測讀板一次，連續檢測讀板3-5d,計算帶綠色熒光的細胞的數量，繪出5d的細胞增殖曲線。細胞每組設置3個復孔。
1.5流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡待各實驗組6cm培養皿細胞生長至覆蓋率約為80%時，胰酶消化后離心獲取轉染后48h的各組細胞，PBS重懸后70%預冷乙醇置于-20 ℃冰箱固定過夜。取出后離心，用450μl預冷PBS重懸細胞。分別加入25μl RNase A溶液和PI染液（濃度為1mg/ml），使其終濃度為50μg/ml,37℃避光孵育30min.吹散細胞，400目篩網過濾后加入流式管中，上機檢測細胞周期。
細胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC/PI試劑盒。消化細胞后收集細胞，離心后用400μl預冷的PBS重懸細胞，加入5μl Annexin V-FITC,輕輕混勻后2-8℃避光孵育15min.隨后加入10μl PI染液，輕輕混勻后2-8℃避光孵育5min.在1h內上機檢測細胞凋亡情況。
1.6 MTT檢測慢病毒轉染SKOV3細胞后的增殖狀態取對數生長期的各組細胞，胰酶消化后以100μl/孔接種于96孔板，每孔約3 000個細胞。從鋪板后第2天開始，連續檢測5d.培養終止前4h加入20μl 5mg/mL MTT于孔中，隨后加入150μl DM-SO,于酶標儀490nm處檢測各孔OD值，分析數據。每組設置3-5個復孔。
2結果
2.1 BTF3慢病毒感染SKOV3細胞后表達情況將成功構建的shBTF3慢病毒載體轉染入SKOV3后，RT-PCR檢測各組BTF3含量顯示，實驗組（sh-BTF3）SKOV3細胞中BTF3基因在mRNA水平的表達量明顯低于對照組（shCtrl）（P<0.05），敲減效率達到94.4%（圖1）。Western Blot檢測細胞中目的基因 敲 減 后 蛋 白 表 達 量，結 果 顯 示shBTF3組SKOV3細胞中，BTF3蛋白水平較對照組顯著降低，說明敲減作用有效（圖2）。
