隨著畜牧業的迅猛發展，各種獸藥的使用量和排放量與日俱增，由此帶來的環境問題也日益受到人們的關注。調查表明，我國使用的獸藥中，抗微生物類用藥占主導地位，市場份額約占 60%以上，其中磺胺類、大環內酯類和喹諾酮類使用較多[1].磺胺類藥物是一類具有對氨基苯磺酰胺結構、以磺酰胺為代表的各種衍生物的總稱[2],通常作為動物飼料添加劑以亞治療劑量添加到動物飼料中，是我國生產量和使用量最大的獸藥之一[3].在長期使用過程中，細菌對磺胺類藥物較容易產生抗藥性，為了達到好的治療效果，其使用量越來越大，而這些藥物不會被動物體完全吸收，有50%~90%的藥物以原藥或代謝物形式隨糞便排出體外[4-6].Elena 等[7]調查了奧地利施用畜禽糞的農用土壤中磺胺類獸藥的殘留含量為 20 mg·kg-1;李彥文等[8]調查得到菜地土壤中磺胺類獸藥的平均殘留含量為 121 μg·kg-1;唐才明等[9]、馬麗麗等[10]調查得到河水污灌區土壤和底泥中磺胺甲惡唑的殘留含量為21.3 μg·kg-1.研究表明，磺胺類獸藥原藥及其代謝產物隨動物糞尿進入環境后，很難完全轉化和降解，經非生物和生物作用逐漸積累，對土壤生態和水環境等帶來影響，并最終會通過食物鏈影響人體健康[11].

目前，對于磺胺類藥物污染的研究主要集中在個體水平的生態毒理效應和遷移轉化等環境行為，以及對土壤環境的影響，關于其遺傳毒性方面的研究開展得較少。生物細胞微核、染色體畸變、有絲分裂指數等細胞遺傳學指標被公認為是評價環境化學物質遺傳性的有效方法之一[12],其中微核試驗具有敏感度高、快速經濟、不需要精尖技術等優點[13],在環境監測中應用較為廣泛。Ma[14]認為高等植物對環境中污染物引起的生物誘變和基因毒性最為敏感，且植物常被用于生物基因毒性測試和相關的土壤評估[15-16].目前關于遺傳毒性的研究中，針對重金屬和有機污染物開展得較多，而獸藥方面的研究較少。本研究在不同濃度的磺胺類獸藥單一及復合污染處理下，通過測定玉米、蠶豆、小麥根尖細胞的微核效應，判斷其遺傳毒性，旨在為研究磺胺類獸藥復合污染對作物遺傳毒性的影響奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米、小麥和蠶豆種子均購于北京開心農場種子公司。

磺胺嘧啶（SD）和磺胺間甲氧嘧啶（SMM）購于北京博亞華牧業科技有限公司；磺胺甲惡唑（SMZ）購于壽光富康制藥有限公司。3 種藥品純度均≥99%.

1.2 試驗方法

1.2.1 單一獸藥脅迫試驗選取籽粒飽滿、均勻的玉米、蠶豆、小麥種子于蒸餾水中浸泡 24 h,待種子吸水膨脹后用紗布包裹置于30 ℃培養箱中培養，每 12 h 換水一次，待根尖長至1~2 cm 時，分別選取發育良好，根尖粗細一致的種子備用。

將 3 種獸藥分別配制成濃度為 1、5、10、50、100mg·L-1的溶液，以蒸餾水作為陰性對照（CK-），以 5mg·L-1的 NaN3作為陽性對照（CK+）。將種子放入不同濃度磺胺類獸藥的處理液中浸泡，染毒 8~24 h,將染毒后的種子洗凈并置于蒸餾水中恢復培養 24 h;切下約 1 cm 長的根尖，卡諾固定液固定 24 h 后，置于70%乙醇中，放入 4 ℃冰箱中可保存數月。實驗時將根尖取出，蒸餾水洗滌 2 次后置于 1 mol·L-1的鹽酸中，于 60 ℃水浴解離 8~10 min,至根尖呈乳白色取出，然后放入蒸餾水中沖洗 3 次，每次 5 min;用 shiff試劑染色 30 min 后漂洗制片，在顯微鏡下觀察。

每個處理每種作物選取 5 個根尖，每個根尖觀察不少于 1000 個細胞，統計細胞的微核數。微核率用觀察到的微核數占觀察細胞的千分率（MCN）表示，微核千分率=微核數/觀察細胞數×1000%.最終結果取 5組根尖觀察結果的平均值。

1.2.2 復合獸藥脅迫試驗將配置好的 3 種獸藥溶液兩兩等量等濃度混合，然后進行作物根尖染毒、固定、解離、染色、觀察，方法與單一獸藥處理相同。

1.3 數據處理采用 SPSS 軟件進行方差分析和 F 檢驗。

2 結果與討論

2.1 單一獸藥脅迫對不同作物根尖細胞微核率的影響磺胺類獸藥對作物產生的毒害作用在個體和細胞分子水平都有所表現。在濃度為 1~5 mg·L-1時，對作物根尖的生長沒有明顯的毒性，從 10 mg·L-1開始，根尖生長緩慢并開始變黃，濃度達到 100 mg·L-1時，根尖顏色加深并開始變硬，水解效果變差，細胞分散程度逐漸降低，部分細胞出現重疊現象。這時壓片比較困難，在顯微鏡下觀察可以看到有些細胞出現了細胞核固縮、細胞破碎的現象，如圖 1 所示。較高濃度的磺胺類藥物可引發細胞凋亡，細胞分裂數減少，說明磺胺類藥物有抑制作物根尖細胞分裂的作用。這和Srivastava 等[17]用較高濃度的固體垃圾滲濾液處理大麥得到的結果一致。

2.1.1 磺胺類藥物對玉米根尖細胞微核率的影響因不同實驗材料監測的結果有很大差異，故較低的微核率是試驗成功的關鍵因素之一[18].在正常情況下，本底微核率不應高于 10%[19].本研究中作物微核率的本底值都在 10%以內，符合污染檢測要求。由表1 可知，與陰性對照組相比，濃度對玉米微核率的影響極顯著（P<0.01），獸藥種類對微核率的影響亦達到極顯著水平（P<0.01）。由表 1 可以看出，5 mg·L-1的 NaN3可顯著誘發玉米的微核效應（P<0.05）。與陰性對照組相比，3 種獸藥在 1~100 mg·L-1濃度范圍內，均可誘發玉米根尖細胞明顯的微核效應，其中 SD、SMM 在 50 mg·L-1時產生的微核率最大，SMZ 在 100 mg·L-1時微核率最大。

在實驗濃度范圍內，玉米根尖細胞微核率隨磺胺類藥物濃度的升高而增大，至藥物濃度 50 mg·L-1時，SD 和 SMM 所誘發的微核率達到最大值，分別為21.86%和 21.52%,濃度進一步增加時微核率反而下降。這可能是由于隨著濃度的升高、毒性的增強，玉米根尖細胞受損，導致細胞周期延長，分生區細胞的分裂減弱，這和易嵐等[20]的研究結果相似。由表 1 還可以看出，SMZ 組在濃度為 5~100 mg·L-1范圍內微核率一直與藥物濃度呈線性關系，相關系數為 0.917 5,但在濃度為 1 mg·L-1時誘發的微核率（8.14%）反而大于5 mg·L-1時的微核率（6.61%）。這可能是因為低濃度的 SMZ 還未表現出相應的毒性，并且能在一定程度上促進玉米根尖分生區細胞分裂，這和韋立秀等[21]用甲醛誘導蠶豆細胞微核所得出的結論相似。

2.1.2 磺胺類藥物對小麥根尖細胞微核率的影響隨著藥物濃度的增大，小麥根尖細胞微核率明顯增加，表明藥物毒性逐漸增強。SD、SMM 和 SMZ 組均在 100 mg·L-1時出現最大微核率。與陰性對照相比，濃度對小麥微核率的影響極顯著（P<0.01），而獸藥種類對微核率的影響不顯著（P>0.05）。故對小麥根尖細胞而言，獸藥種類的改變對其微核率無明顯影響。

SMM 和 SMZ 處理組中，小麥根尖細胞的微核率在濃度為 100 mg·L-1時達到最大值，分別為 20.17%和 17.44%;當濃度升高到 200 mg·L-1時，微核率分別降至 18.63%和 16.01%.由表 1 可知，SMM 各濃度的小麥根尖細胞微核率均大于 SMZ,說明小麥根尖細胞對 SMM 的敏感度高于 SMZ.而 SD 處理下，小麥細胞的微核率在 1~100 mg·L-1范圍內與藥物濃度呈線性增長關系，相關系數為 0.963,微核率在 100 mg·L-1時達最大值 20.27%,說明小麥根尖細胞在高濃度 SD作用下才能誘發較大微核率，小麥根尖細胞對 SD 的敏感度較弱。

2.1.3 磺胺類藥物對蠶豆根尖細胞微核率的影響由表 1 可知，3 種獸藥在 1~100 mg·L-1濃度范圍內均對蠶豆根尖細胞產生明顯的毒性作用。SD 組在10 mg·L-1時微核率達到最大值 25.94%,而 SMM、SMZ 組在 50 mg·L-1時微核率分別達到最大值23.61%和 20.53%,說明蠶豆對 SD 的敏感性高于SMM 和 SMZ.對蠶豆而言，獸藥濃度對微核率的影響極顯著（P<0.01），獸藥種類對微核率的影響亦極顯著（P<0.01）。在同一濃度作用下，SD、SMM、SMZ 誘發蠶豆根尖的微核率均明顯高于玉米和小麥，在 SMM 處理下，50 mg·L-1時蠶豆微核率為 23.61%，玉米和小麥分別為 21.52%和 18.22%，表明同種藥物同一濃度作用下，蠶豆根尖細胞受損更嚴重。這說明蠶豆根尖細胞對磺胺類藥物較敏感，且染色體較大，便于觀察，更適合作為磺胺類藥物污染的指示作物[22].

2.1.4 不同作物對磺胺類藥物敏感性的比較微核產生的主要原因是各種具有損傷性的理化因子影響了細胞功能，造成了細胞損傷[23].本研究中，磺胺類藥物能誘發 3 種作物根尖細胞微核，表明這類藥物可以引起作物根尖細胞 DNA 損傷，因而是一種潛在的致突變劑和致癌物質。

由表 1 可知，不同種類的磺胺類獸藥對同一作物的微核率影響不同，而不同作物對同一獸藥的敏感性也不同。SD 處理下，蠶豆的微核率高于玉米和小麥。

當 SD 濃度為 10 mg·L-1時，蠶豆的微核率達到最大值 35.94%，玉米的微核率為 16.59%，小麥的微核率為 12.87%。由此可知，在相同濃度 SD 作用下，3 種作物的敏感性為蠶豆>玉米>小麥。SMM 組 3 種作物的微核率隨濃度變化情況如表 1 所示，50 mg·L-1時蠶豆和玉米均達到最大值，分別為 23.61%和21.52%，小麥的微核率為 18.22%，可見蠶豆和玉米對 SMM 的敏感程度高于小麥。但在同一濃度下，蠶豆根尖細胞的微核率大于玉米，說明 3 種作物的根尖細胞對SMM 的敏感性為蠶豆>玉米>小麥，與 SD 作用下作物表現的敏感性相同。SMZ 處理組中，50 mg·L-1時蠶豆微核率達到最大值 20.53%，小麥微核率為 15.76%，而玉米隨藥物濃度升高微核率的增長最為緩慢，為12.77%。由此得出，3 種作物的根尖細胞對 SMZ 的敏感順序為蠶豆>小麥>玉米。產生這種差異的原因可能是，同種藥物對不同作物根尖細胞的作用機理不同。相同濃度下，蠶豆比玉米、小麥具有更高的微核率，這可能是因為小麥和玉米具有更強的抗氧化能力[24].

2.2 3 種磺胺類獸藥復合對作物根尖細胞微核率的影響圖 2 顯示，與獸藥單一作用相比，在 1~50 mg·L-1濃度范圍內，獸藥復合作用的微核率較高，說明低濃度的獸藥復合毒性高于單一毒性；當濃度升高至 50~100 mg·L-1時，復合作用產生的微核率明顯降低，說明獸藥的復合在低濃度表現出協同作用，高濃度則表現出拮抗作用。這可能是因為低濃度時細胞分裂比較旺盛，在藥物毒性作用下，產生微核的細胞數較多，隨著濃度升高，藥物毒性作用增大，細胞死亡數量增多，微核率大大減少。方差分析可知，不同種類獸藥復合對作物根尖細胞微核率影響顯著（P<0.05），復合獸藥濃度對作物根尖細胞微核率影響極顯著（P<0.01）。

玉米、蠶豆在 1 mg·L-1SMZ 單一處理下表現出的低促作用在 SD-SMZ、SMM-SMZ 復合時消失，說明低濃度獸藥復合不會加快作物細胞的有絲分裂。5~10mg·L-1時，SD-SMM 復合作用下微核率上升較快，可能是因為較低濃度的復合獸藥在尚未抑制細胞分裂的條件下表現出較高的毒性，以致在這個濃度范圍內，微核率呈明顯上升趨勢；當濃度上升至 50 mg·L-1時，微核率達最大值，而當濃度繼續增大時微核率開始下降，可能是因為高濃度 SD-SMM 毒性增強，抑制細胞分裂，使微核量減少；當各復合濃度增至 100mg·L-1時，與單一作用比較，微核率差別很小，可能是因為此時 SMM 產生的毒性已足夠引起細胞大量死亡，再加入其他獸藥對微核率的變化無明顯影響。

由圖 2 可以看出，在 3 種獸藥復合處理下，蠶豆根尖微核率在 10 mg·L-1時即達到最大值，且最大值明顯高于玉米和小麥。這說明在復合獸藥的處理下，蠶豆仍是最敏感的作物。

SD-SMM 復合處理下，3 種作物所誘發的微核率均比單一獸藥高。蠶豆在 10 mg·L-1達到最大微核率26.13%，比 SD 單一處理時高 6.9%,比 SMM 單一處理時高 10.7%.玉米和小麥亦表現出相同規律。由此可見，在 SD-SMM 復合污染作用下，復合毒性增強，具有協同效應。

SD-SMZ 復合處理下，玉米、小麥均在 100 mg·L-1時達到最大值，分別為 19.67%和 21.53%，高于單一SD、SMZ 處理所得微核率的最大值；小麥根尖微核率的增長幅度高于玉米，說明 SD-SMZ 復合對小麥的毒性較大。

SMM-SMZ 復合在 1~100 mg·L-1范圍內，3 種作物微核率均隨濃度增加而顯著升高，且 3 種作物在各個濃度的微核率高低順序均為蠶豆>玉米>小麥。濃度高于 50 mg·L-1時，3 種作物的微核率逐漸趨于相近，此時 SMM-SMZ 復合表現出拮抗作用。出現這種現象可能是因為 SMM 與 SMZ 的衍生基團處于苯環上同一位置，結構的相似導致兩種獸藥的作用機理相似。在染毒過程中，2 種獸藥在作物細胞染色體上的結合位點可能相同，故出現競爭機制。在低濃度（1~10 mg·L-1）作用下，結合位點尚未飽和，兩種獸藥分子均可與位點結合，對作物產生毒害加劇，相同濃度下SMM-SMZ 復合比單一作用產生的微核率高，并在 10mg·L-1時達到最大值。隨著濃度繼續升高至 50~100mg·L-1,細胞 DNA 結合位點逐漸飽和，兩種獸藥分子因不能與 DNA 有效結合而無法產生更強的毒性作用。因此，SMM-SMZ 復合高濃度下，3 種作物的微核率下降并趨于一致。

3 結論

（1）3 種磺胺類藥物對作物細胞均具有遺傳毒性，但不同的作物對同一藥物的敏感性不同。SD 和SMM 的處理下，3 種作物的敏感性順序為蠶豆>玉米>小麥；SMZ 處理下，3 種作物的敏感性順序為蠶豆>小麥>玉米。

（2）復合污染條件下，單一獸藥對作物的低促作用會消失，且低濃度磺胺類獸藥的復合毒性高于單一毒性。

（3）獸藥的復合在低濃度表現出協同作用，高濃度則表現出拮抗作用，這可能與獸藥分子的結構及其與 DNA 分子的結合位點有關。

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