腸易激綜合征\\(irritable bowel syndrome，IBS\\)是常見的功能性腸病，臨床上以腹痛或腹脹，常伴有排便習慣改變和\\(或\\) 糞便性狀改變為特征，多缺乏公認的形態學、生化指標或基因異常的改變，常分為腹瀉型腸易激綜合征、便秘型腸易激綜合征和交替型腸易激綜合征［1-3］。IBS-C 屬于中醫“便秘”、“氣秘”、“脾虛”等范疇，病機關鍵在于脾虛氣滯，但與肝的關系密切。肝郁是本病的一個誘因，脾虛氣弱是本病的一個基本病理過程，肝郁脾虛氣滯是 IBS-C 發病的一個重要病理機制。肝與情緒惱怒變化關系最為密切，因肝為將軍之官，不受遏郁，主疏泄氣機，易為情志所傷，而肝木有病則氣機拂郁，脾運化受制。因此，IBS-C 是因肝郁日久傷脾，加之素體脾氣虛弱，中氣不足，推動無力，氣虛而滯導致大腸傳導功能失常［4-6］。
前期研究已完成了 IBS-D 動物模型的建立及評價，發現早期母嬰分離能造成腦-腸軸功能的紊亂［7，8］，為本研究提供了借鑒。目前，便秘動物模型的建立多采用冰水灌胃法、黃連素或復方地芬諾酯誘導法、禁水不禁食法等［9，10］，前期研究表明，這些方法所建立的模型具有便秘的特征，其重復性和穩定性均較好，但無法復制 IBS-C 反復發作的臨床特征，且停止刺激后動物可自愈，不適合應用于藥效驗證。本研究擬采用早期母嬰分離誘導腦-腸軸功能紊亂，分別結合冰水灌胃法、限水法制作 IBS-C 大鼠模型，并建立其評價體系，篩選出最佳的 IBS-C 模型。
1 材料與方法
1. 1 實驗動物
剔除雌性的初生 SD 乳鼠 20 窩\\(133 只\\) ，SPF級，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心【SCXK\\(粵\\)2013-0020】，與母鼠同籠，第 21 天后斷奶并與母鼠分籠，實驗操作在廣州中醫藥大學第一附屬醫院SPF 級實驗設施中進行【SYXK\\(粵\\) 2013-0092】，常規攝食飲水，光照為保持晝夜節律各 12h。溫度控制在 18 ～24℃，相對濕度控制在 50% ～ 70%，實驗時室溫維持在 24 ～26℃。
1. 2 主要儀器與試劑
電子分析天平\\(日本島津\\) ; 烘箱\\(蘇州臺華烘箱設備有限公司\\) ; 大鼠糞尿分離代謝籠\\(北京佳源興業科技有限公司\\) ; Olympus-BX60 光學顯微鏡，O-lympus-DP10 數碼相機，均購于日本奧林巴斯公司;直腸擴張實驗儀為本實驗室自制。
1. 3 動物分組
取 SD 大鼠 20 窩，按窩隨機分為 6 組。A 組 3窩 18 只，B 組 3 窩 23 只，C 組 3 窩 19 只，D 組 4 窩26 只，E 組 3 窩 19 只，F 組 4 窩 28 只。其中 A 組作為正常組，B 組為母嬰分離組，C 組為冰水灌胃組，D組為母嬰分離結合冰水灌胃組，E 組為限水組，F 組為母嬰分離結合限水組。
1. 4 造模方法
各組大鼠均從出生后適應性飼養 1 周，第 21 天斷奶，雌雄分籠。分別按照以下方法造模:母嬰分離法［11］: 每天將乳鼠與母鼠分離，單籠飼養 180 min 后再與母鼠同籠飼養，共 14 天。冰水灌胃法［9］: 給予大鼠0 ～4℃生理鹽水2 mL灌胃，每日 1 次，共 14 d。限水法: 采用普通飲水瓶手持輔助飲水，每天分兩次給水，第一次給 1/3，第二次給 2/3，間隔 12 h。
于開始限水第 1、2 天分別給予未限水前 5d 平均水量的 1/6，第 3 ～ 6 天給 1/5，第 7 ～ 10 天給 1/4，第10 ～ 14 天給 1 /3，取整數值。
A 組正常飼養，不做任何處理; B 組從第 8 ～ 21天進行母嬰分離操作，之后正常飼養; C 組第 8 ～21天正常飼養，第 22 ～ 35 天冰水灌胃; D 組第 8 ～ 21天進行母嬰分離，第22 ～35 天冰水灌胃; E 組第8 ～21 天正常飼養，第 22 ～ 35 天限水; F 組第 8 ～ 21 天進行母嬰分離，第 22 ～35 天限水。
2 結果
2. 1 模型的評價
2. 1. 1 大鼠一般行為及生理指標評價
造模結束后\\(第 36 天\\) 觀察并記錄各組大鼠的毛色、大便、進食和飲水、精神狀態等。結果 A 組活動快速，毛發濃密有光澤，進食和飲水正常，大便未見異常; B 組大鼠活動正常，毛發有光澤，進食和飲水正常，形體略有消瘦，可見便溏或便秘; C、D、E、F組大鼠出現毛色無光澤且豎起、拱背、活動減少、易躁易怒、進食量減少、形體消瘦、大便數量減少且顆粒變小質地堅硬。分別隨機抽取各組大鼠 10 只，測定各組大鼠體重及 24h 進食量，結果見表 1。
體重測定結果發現，母嬰分離組和正常組大鼠體重差異無顯著性\\(P ＞0. 05\\) ，而以冰水灌胃法、限水法及母嬰分離結合冰水灌胃法、限水法的大鼠的體重較母嬰分離組和正常組比較均顯著降低\\(P ＜0. 05\\) ; 與母嬰分離組和冰水灌胃組比較，母嬰分離結合冰水灌胃法體重顯著下降 \\(P ＜ 0. 05，P ＜0. 05\\) ; 與母嬰分離組比較，限水組和母嬰分離結合限水組的體重均顯著下降\\(P ＜ 0. 05\\) ，但限水組和母嬰分離結合限水組的體重差異無顯著性。
進食量的研究結果表明，與正常組大鼠比較，其他各組大鼠的 24 h 進食量均顯著降低\\(P ＜0. 05\\) ;與母嬰分離組比較，冰水灌胃組、母嬰分離結合冰水灌胃組和母嬰分離結合限水組 24h 進食量顯著降低\\(P ＜0. 05\\) ; 母嬰分離結合冰水灌胃組的 24 h 進食量顯著低于冰水灌胃組\\(P ＜ 0. 05\\) ，但母嬰分離結合限水組 24 h 進食量顯著高于母嬰分離結合冰水灌胃組\\(dP ＜ 0. 05\\) ，與限水組的 24 h 進食量差異無顯著性\\(P ＜0. 05\\) 。
2. 1. 2 糞便相關評價
每組取 3 只大鼠解剖，觀察各腸道糞便分布及形態。結果發現，A 組和 B 組大鼠回腸和結腸中可見呈軟柱狀大便，空腸中無明顯糞便殘留; C、D、E、F組大鼠糞便集中于結腸部，多呈連珠狀或球狀，色澤較深，空腸和回腸無明顯糞便殘留。
依據前期研究［8］，分別于造模結束后\\(第 36天\\) 隨機抽取每組大鼠 10 只單獨置于代謝籠中，禁水禁食，收集 4 h 內大鼠的糞便，記錄 4 h 內排便顆粒數，根據 Bristol 大便性狀圖譜［2］記錄大便形態，并按照中國藥典附錄烘干法測定糞便含水量。結果見表 1。
由表 1 可知，與 A 組比較，C、D、E、F 組大鼠的排便顆粒數顯著減少\\(P ＜ 0. 05\\) ，Bristol 積分和糞便含水量均顯著降低\\(P ＜ 0. 05\\) ; B 組大鼠的排便顆粒數、Bristol 積分和糞便含水量無明顯變化，但波動較大，Bristol 積分體現出腹瀉或便秘兩種狀態; 與B 組比較，C、D、E、F 組的排便顆粒數、Bristol 分型積分值和糞便含水量均顯著降低\\(P ＜0. 05\\) ; C、D、E、F 組之間的糞便指標差異無顯著性。結果提示，冰水灌胃法、限水法和母嬰分離結合冰水灌胃、限水建立的模型均表現出排便顆粒數減少、糞便含水量下降及糞便分型積分降低等癥狀，符合便秘的臨床特征。
2. 1. 3 腸道敏感性評價
于造模結束后第 36 天隨機抽。取各組大鼠 10只，參考前期研究［8］，測定各組大鼠腹部回縮反射評分為 3 分時的壓力閾值，每只大鼠測定 3 次，間隔5 min。結果見表 1。由表 1 可知，與 A 組比較，B、C、D、F 組的腸道壓力閾值顯著降低\\(P ＜ 0. 05\\) ，E組的壓力閾值無顯著改變\\(P ＞ 0. 05\\) ; 與母嬰分離組比較，母嬰分離結合冰水灌胃組的腸道壓力閾值顯著降低\\(P ＜ 0. 05\\) 。結果提示母嬰分離法、冰水灌胃法、母嬰分離結合冰水灌胃和母嬰分離結合限水法均能導致腸道敏感性升高，限水法對腸道敏感性無明顯影響，其中母嬰分離結合冰水灌胃法的腸道超敏感性最為顯著。
2. 1. 4 結腸組織形態學觀察
經解剖觀察，C、D、E、F 組大鼠糞便多集中于結腸部，空腸和回腸較少，提示大鼠便秘狀態可能與結腸組織功能改變有關。取各組大鼠的結腸 2cm，生理鹽水洗凈，浸入 5%甲醛溶液中，使用脫水機和包埋機對結腸標本進行石蠟包埋，切成 2 μm 厚度的切片，蘇木素染色，置于光鏡下觀察。結果見圖 1。
由圖 1 可見，正常組、母嬰分離組、冰水灌胃組、母嬰分離結合冰水灌胃組結腸組織完整，未見糜爛及潰瘍，杯狀細胞形態和數量無顯著改變，未見水腫及炎細胞浸潤。限水組和母嬰分離結合限水組結腸組織完整，未見糜爛和潰瘍，杯狀細胞和數量無顯著改變，但可見中性粒細胞減少和少量炎細胞浸潤。
2. 4 模型的驗證
根據 2. 3 項下的模型評價結果，最終確定以母嬰分離結合冰水灌胃法建立的大鼠模型為 IBS-C 模型。該 IBS-C 模型一般行為學表現出肝郁證和脾虛證的特點，具有排便顆粒數減少、糞便形態改變及糞便含水量顯著降低等臨床便秘的特征，腸道敏感性顯著升高且腸組織無明顯的病理改變，提示以該方法建立的模型能較高程度擬合 IBS-C 的臨床特點，且表現出肝郁脾虛的中醫證候特點。故采用具有疏肝解郁、理氣健脾的名方逍遙散作為干預藥物進行反證。
取乳鼠 3 窩 28 只，按照 2. 1 項下母嬰分離結合冰水灌胃法建立 IBS-C 大鼠模型，并對模型進行評價，以排便顆粒數減少、糞便形態改變及糞便含水量顯著降低，腸道敏感性顯著升高的大鼠為成功的IBS-C 模型，計算造模成功率為 82% 。取符合要求的 IBS-C 模型大鼠 23 只，隨機分為模型對照組和藥物驗證組。于造模結束當天，藥物驗證組每日給予逍遙散一包溶于3 mL 蒸餾水灌胃給藥，模型組每天灌胃蒸餾水 3 mL，持續一周。另取一窩 14 只健康乳鼠不作任何處理，在模型組和藥物驗證組給藥時同法灌胃蒸餾水 3 mL。分別測定給藥結束后排便顆粒數、Bristol 積分、糞便含水量和腸道壓力閾值，結果見表 2。
由表 2 可知，與正常組比較，母嬰分離結合冰水灌胃法建立的 IBS-C 模型大鼠的排便顆粒數、Bristol積分值、糞便含水量和腸道壓力閾值均顯著降低\\(P＜ 0. 05\\) ; 以逍遙散干預后糞便指標和壓力閾值均顯著升高\\(P ＜ 0. 05\\) ，且腸道壓力閾值與正常組無顯著差異。結果表明，具有疏肝解郁、益氣健脾功效的逍遙散可較好的改善母嬰分離結合冰水灌胃所致IBS-C 大鼠的排便異常和腸道超敏感性。結合該模型大鼠的一般行為學特征所表現的肝郁證和脾虛證，提示以母嬰分離結合冰水灌胃所建立的 IBS-C模型符合中醫肝郁脾虛證的特點。
3 討論
目前的便秘模型主要有寒積型便秘、實熱型便秘、燥結失水模型、氣虛型、陽虛型、陰虛血瘀型、脾虛型和藥物型［9，12，13］，但這些模型只能模擬出便秘的臨床特征，不符合 IBS-C 的臨床癥狀，且未能與IBS-C 的中醫病因病機相符合，體現“肝郁脾虛證”相似的主要癥狀。本研究在分析和總結目前關于IBS 和便秘模型的基礎上，從造模的思路、理論依據、觀察指標等，考察了母嬰分離法、冰水灌胃法、限水法和母嬰分離結合冰水灌胃法、母嬰分離結合限水法建立的便秘模型及其中醫證候特點。
莫國強等［14］研究發現，母嬰分離法可導致大鼠腸道敏感性增強，表現出類似腸易激綜合征的腸道痛閾值降低反應，提示采用母嬰分離結合目前的便秘模型造模方法或許可以誘導高擬合度的 IBS-C 模型。本研究結果顯示，當初使用母嬰分離法建立的模型具有腸道敏感性升高的特點，但其排便顆粒數、Bristol 分型積分和糞便含水量波動較大，呈現便秘、正常和腹瀉三種狀態。提示母嬰分離能引起大鼠腸道痛閾值降低，使得排便出現異常，可能與大鼠腦-腸軸功能紊亂有關［11］。
大鼠有隨時排便的習性，且其糞便形態和含水量與大鼠體重和飼料有關。為避免實驗人為差異，本研究將各組大鼠喂以干燥的標準飼料，并單獨飼養于代謝籠中使糞尿分離。本研究發現，以限水法制作的便秘模型腸道敏感性無顯著變化，且結腸組織出現炎細胞浸潤; 以母嬰分離結合限水法制作的便秘模型雖然腸道敏感性顯著升高，但結腸組織也出現炎細胞浸潤。且對于采用了限水法的大鼠來說，干燥的飼料使其吞咽困難，表現為給水后進食，因而進食量和大便量影響較大，不易控制。因此，以限水法和母嬰分離結合限水法制作的模型不符合IBS-C 的臨床特征且穩定性較差。
研究發現，以母嬰分離結合冰水灌胃建立的大鼠模型具有排便顆粒數減少、糞便形態改變及糞便含水量顯著降低、腸道敏感性顯著升高且腸組織無明顯的病理改變的 IBS-C 臨床特征，與文獻報道一致［15，16］，又表現出易躁易怒、活動減少、進食量減少、形體消瘦特點，而采用具有疏肝解郁、理氣健脾功效的逍遙散進行反證，發現肝郁脾虛證的癥狀有較大好轉。本研究結果提示，提示采用母嬰分離結合冰水灌胃法建立的大鼠模型屬于肝郁脾虛證 IBS-C 模型。
參考文獻：
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