支氣管哮喘\\(bronchial asthma\\)簡稱哮喘,是由多種細胞\\(嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等\\)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]
,中醫學屬于哮病范疇?，F今全球哮喘患者約有1.5億,造成的損失超過結核病和艾滋病的總和,發達地區哮喘的發病率高于欠發達地區[2]
,污染地區哮喘的發病率高于非污染地區,許多發達國家哮喘患病率呈上升趨勢[3]
,我國哮喘的發病率低于發達國家,死亡率位居全球第一,嚴重影響我國公民的身體健康,造成了巨大的社會醫療負擔[4]
。本課題組既往研究發現腎虛痰瘀型哮喘的病機最 為復雜,病情較其他證型偏重,治療效 果較差[5]
。復雜性疾病的背后往往是整體生物學基礎紊亂的狀態,“證”能夠反映疾病過程在某一個階段的病理生理癥狀與體征群,代表復雜性疾病及其背后整體生物學基礎紊亂狀態。代謝組學通過從整體上觀察生物學的內在系統信息,判斷出生物體的病理生理狀態;核磁共振\\(NMR\\)代謝組學技術作為一種高效非破壞性分析方法在現代醫學[6-7]
及傳統醫學研究中已廣泛應用[8-9]
。本研究利用代謝組學平臺,通過對健康人、腎虛痰瘀型哮喘患者、非腎虛痰瘀型哮喘患者血漿進行檢測和分析,從樣品中得到小分子物質譜圖,探尋腎虛痰瘀證特異性代謝產物,確定中醫“同病異證”生物學物質基礎,豐富支氣管哮喘中醫“同病異證”性理論。
1 資料及方法
1.1 臨床資料
通過體檢確定身體健康的志愿者61例\\(健康組\\),其中男性30例,女性31例,平均年齡為18~60歲。選擇2012年10月-2013年9月在新疆醫科大學附屬中醫醫院呼吸科就診的支氣管哮喘患者140例\\(哮喘組\\),其中腎虛痰瘀證哮喘組70例,非腎虛痰瘀證哮喘組70例\\(冷痰哮、熱痰哮、寒包熱痰哮、風痰哮\\),經入院檢查確診,年齡16~60歲,詳細記錄病人基本信息\\(病史、性別、年齡、族別等\\)。中華醫學會呼吸病學分會支氣管哮喘學組制定的“支氣管哮喘防治指南\\(支氣管哮喘的定義、診斷、治療及教育和管理方案\\)”為支氣管哮喘診斷標準;根據《中醫診斷學》[\\(人民衛生出版社\\(第5版\\)]及《中華人民共和國國家標準·中醫臨床診療術語證候部分》擬定中醫腎虛痰瘀證標準。哮喘組納入標準:\\(1\\)年齡18~70歲;\\(2\\)符合支氣管哮喘的診斷標準;\\(3\\)處于急性發作期并在急性發作的患者和曾經有支氣管哮喘發作史的非發作期患者;\\(4\\)在新疆生活居住時間≥10a的居民。排除標準:\\(1\\)經檢查證實為結核、真菌、矽肺、腫瘤等因素所致,持續性慢性咳嗽、喘息患者;\\(2\\)明確診斷合并有原發性心血管疾病、肝臟病變、腎臟疾病、糖尿病、造血系統疾病、精神病等患者及其他嚴重并發癥的患者;\\(3\\)無法確診或資料不全的患者。
1.2 樣品的采集與血漿核磁共振氫譜的測試
1.2.1 樣品的采集經患者和健康志愿者知情同意,采清晨空腹肘靜脈血,肝素鈉抗凝,4℃3 000r/min離心10min,分離血漿,置-80℃超低溫冰箱保存。
1.2.2 血漿核磁共振氫譜的測試血漿樣品經室溫解凍后,取血漿200μL加正磷酸鹽緩沖液400μL[溶質:0.45mol/L Na2HPO4,0.45mol/L K2HPO4;溶劑為80%H2O/20%D2O\\(含TSP 0.05%\\),pH=7.4]混勻,去除pH化學位移影響,室溫放置10min后,10 000r/min離心10min。取550μL上清液加入5mm核磁管。
Inova 600MHz核磁共振波譜儀進行1H-NMR譜的測定,調用CPMGPREST-1D脈沖序列\\(RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ\\)進行檢測。測定溫度設定為25℃,預飽和方式抑制水峰,飽和時間為2s,采樣點數32k。掃描次數128次,譜寬為10 000Hz。
譜圖中的各種峰的指認,選取已測1H-NMR譜數個樣品進行1H-1H同核相關譜\\(1H-1H COSY,1H-1HHomonuclear correlation spectroscopy\\)、質子全相關譜\\(TOCSY,Total correlation spectroscopy\\)、J-分解譜\\(J-RES,J-resolved spectroscopic\\)二維譜測試,輔助代謝成分的鑒定。
1.3 數據處理與分析
1.3.1 數據處理血漿樣品1H-NMR譜經基線及相位調整后,以α葡萄糖左峰作為化學位移參考峰的位置設為5.233ppm。選擇δ9~δ0.5ppm的區域進行自動分段積分,積分區間設為0.003ppm,積分結果以文本格式保存導人到Excel表內,去除δ4.66~δ5.22ppm范圍水峰信號,對各分段積分值進行歸一化\\(樣品每一段積峰值與所有積峰值和的比值\\)后進行模式識別分析。
1.3.2 數據分析采用SIMCA-P+11軟件進行正交偏最小二乘判別分析\\(OPLS-DA\\),經統計分析獲得每一積分段所代表的代謝產物的相關系數 \\(r\\),確定健康組與腎虛痰瘀型哮喘組、腎虛痰瘀型哮喘組與非腎虛痰瘀型哮喘組血漿中差異性代謝產物成分,通過皮爾森相關系數顯著性差異檢測\\(相關系數的臨界值相當于顯著性差異水平,P <0.05\\),確定0.250、0.232作為代謝物變化是否具有顯著性差異的閾值 \\(n =60|r|>0.250,n =70|r|>0.232\\),相關系數絕對值大于閾值代表的代謝物差異有統計學意義 \\(P <0.05\\)。
2 結果
通過1H-NMR譜圖和COSY、TOCSY、J-RES等二維譜對健康組與腎虛痰瘀型哮喘組、腎虛痰瘀型哮喘組與非腎虛痰瘀型哮喘組血漿中差異性代謝產物成分進行了信號歸屬。健康組、腎虛痰瘀型哮喘組及非腎虛痰瘀型哮喘組血漿1H-NMR譜圖見圖1。健康組與腎虛痰瘀型哮喘組、腎虛痰瘀型哮喘組與非腎虛痰瘀型哮喘組血漿1H-NMR譜圖進行OPLS-DA分析的結果空間分布圖見圖2\\(OPLS-DA分析的結果空間分布圖中1個點代表1個標本,健康組與腎虛痰瘀型哮喘組、腎虛痰瘀型哮喘組與非腎虛痰瘀型哮喘組空間位置區域分開,表明各組樣品的代謝成分有差異\\)。健康組、腎虛痰瘀型哮喘組及非腎虛痰瘀型哮喘組血漿中差異性代謝產物見表1?！颈?略】
健康組與腎虛痰瘀型哮喘組、腎虛痰瘀型哮喘組與非腎虛痰瘀型哮喘組的代謝表型發生了變異,OPLS-DA分析空間分布圖可見各組分類情況較好。腎虛痰瘀型哮喘組與健康組比較,血漿中異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、谷氨酰胺、肉堿、酪氨酸、肌酸、組氨酸、鯊肌醇、甘氨酸、葡萄糖、蘇氨酸、肌醇、1-甲基組氨酸降低,肌酸升高,差異有統計學意義 \\(P <0.05\\);腎虛痰瘀型哮喘組與非腎虛痰瘀型哮喘組比較,腎虛痰瘀型哮喘組血漿中丙酮酸、甘氨酸等化合物含量較高,差異有統計學意義 \\(P <0.05\\);非腎虛痰瘀型哮喘組血漿中異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、丙酮、酪氨酸、1-甲基組氨酸等化合物含量較高,差異有統計學意義 \\(P <0.05\\)?！緢D1略】
3 討論
支氣管哮喘的病理生理過程多以氣道高反應性、氣道炎癥及可逆性氣道阻塞為主,其中氣道炎癥是氣道阻塞、氣道高反應性的病理基礎。體液中的代謝物質與細胞、組織和整體水平的生物化學狀態密切相關,內環境的任何變化都會導致體液中代謝物質發生變化,進而在血液等體液的代謝型中得到表現。
研究表明,腎虛與神經內分泌緊密相關,與神經損傷存在一定的相關性,腎素、血管緊張素及醛固酮水平與腎陰虛證相關,腎陽虛多與能量利用異常相關。本研究發現腎虛痰瘀型哮喘組血漿中1-甲基組氨酸、酪氨酸、葡萄糖、乳酸、丙酮降低,丙酮酸、甘氨酸升高;1-甲基組氨酸去甲基生成組氨酸經組氨酸脫羧酶催化生成組胺,酪氨酸經酪氨酸羥化酶合成兒茶酚胺\\(多巴、去甲腎上腺素、腎上腺素\\);葡萄糖為糖酵解原料,中間產物丙酮酸、乳酸,丙酮由肝細胞線粒體生成釋放入血,呼吸肌收縮一部分 能 量 由 糖 酵 解 供 應,另 一 部 分 來 源 于 脂 代謝,脂肪分解中間產物乙酰CoA對丙酮酸脫氫酶活性有抑制作用,抑制丙酮酸脫氫,促進乳酸脫氫變成丙酮酸;甘氨酸、精氨酸經脒基轉移酶合成胍乙酸,胍乙酸經甲基轉移酶生成肌酸,肌酸為能量儲存與利用的重要化合物。故推測腎虛痰瘀型哮喘患者為腎陰陽俱虛,機體處于能量利用異常,主要表現為糖代謝及脂代謝方面,血漿中葡萄糖、乳酸、丙酮含量降低與丙酮酸、甘氨酸升高可能是腎虛的生物學標志 物。痰 淤 證 與 免 疫 炎 癥 介 質 存 在 密 切 的 關聯,“痰可挾瘀”、“瘀可致痰”,痰、瘀兩者相互交結,形成痰瘀交阻,痰證、瘀證、痰瘀交阻證統視為“痰瘀證”;本研究發現腎虛痰瘀證支氣管哮喘患者血漿中異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸含量降低。
亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸同時具有能量、糖異生底物及肌蛋白代謝調節作用,參與持續病理消耗狀態下供能及蛋白質合成和分解,調節機體免疫功能,提高運動能力;蘇氨酸參與必須營養氨基酸與糖代謝、脂代謝、轉氨基,與免疫蛋白的合成密切相關,推測痰瘀證血漿代謝組學的生物學標志物可能是異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸和酪氨酸。
綜上所述,腎虛痰瘀型哮喘患者的代謝表型、代謝網路、代謝產物發生改變,腎虛痰瘀證可能是其他型哮喘發展的終點,中醫分型中也可能是最終表現形式,與本課題組既往研究結果一致。通過研究初步確定腎虛痰瘀證哮喘患者可能的生物學物質基礎是異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、丙酮、酪氨酸、1-甲基組氨酸降低,丙酮酸、甘氨酸升高。明確腎虛痰瘀證在微觀生物學存在一定的物質基礎,支氣管哮喘中醫存在一定再分性,中醫支氣管哮喘“同病異證”理論存在微觀生物學物質基礎,為今后哮喘中醫證型腎虛痰瘀證的劃分提供一定內在依據。
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