[摘要] 目的 探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/ 真核生物始動因子 4E 結合蛋白 1（4EBP1）/ 缺氧誘導因子 -1α（HIF-1α）/ 血管內皮生長因子（VEGF）信號通路在哮喘小鼠中的表達及意義。方法 40只 SPF 級 6~8 周齡雌性 Balb/c 小鼠隨機分為對照組、哮喘組、布地奈德干預組及 mTOR 抑制劑（雷帕霉素）干預組，每組 10 只。卵清蛋白致敏激發建立哮喘小鼠模型，各干預組分別在激發前 30 min 給予雷帕霉素 3 mg/kg腹腔注射或布地奈德混懸液 1 mg 霧化吸入，對照組和哮喘組以生理鹽水代替。于末次激發 24 h 后處死小鼠，收集肺泡灌洗液（BALF），采用 ELISA 法測定 HIF-1α、VEGF 水平；取肺組織行蘇木精 - 伊紅（HE）染色觀察其病理變化；免疫組化染色和 Western blot 法測定肺組織磷酸化的 mTOR 及 4EBP1（p-mTOR 及 p-4EBP1）蛋白表達水平。Pearson 法分析 p-mTOR、p-4EBP1、HIF-1α、VEGF 表達的相關性。結果 與對照組相比，哮喘組氣管及其周圍炎性細胞浸潤明顯，分泌物增多；BALF 中 HIF-1α、VEGF 水平顯著升高（P<0.01）；肺組織 p-mTOR、p-4EBP1 表達顯著增加（P<0.01）。與哮喘組相比，各干預組氣道炎癥浸潤明顯減輕，分泌物減少；BALF 中 HIF-1α、VEGF 水平明顯下降（P<0.01）；肺組織 p-mTOR、p-4EBP1 表達顯著降低（P<0.01）。對照組及兩干預組間相比上述指標變化差異均無統計學意義（P>0.05）。哮喘組小鼠 p-mTOR、p-4EBP1、HIF-1α、VEGF 表達水平兩兩互呈正相關（P<0.05），而對照組及兩干預組各指標間無相關性（P>0.05）。結論 哮喘發生時 p-mTOR、p-4EBP1、HIF-1α、VEGF 可能協同參與了哮喘的發病過程。雷帕霉素能阻斷這一過程，可能作為治療哮喘的新靶點。 [中國當代兒科雜志，2017,19（1）：104-110]
[關鍵詞] 哮喘；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；真核生物始動因子 4E 結合蛋白 1;缺氧誘導因子 -1α；血管內皮生長因子；小鼠。
Abstract: Objective To study the expression and significance of the mammalian target of rapamycin （mTOR）/eukaryote initiating factor 4E binding protein 1（4EBP1）/hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α）/vascular endothelialgrowth factor （VEGF） signaling pathway in asthmatic mice. Methods Forty SPF level 6-8 week-old female Balb/C mice were randomly divided into control, asthma, budesonide and mTOR inhibitor （rapamycin） intervention groups（n=10 each）。 The asthmatic mouse model was prepared via OVA induction and challenge test. The intervention groupswere administered with rapamycin at the dosage of 3 mg/kg by an intraperitoneal injection or budesonide suspensionat the dosage of l mg by aerosol inhalation respectively 30 minutes before the OVA challenge. The control and asthmagroups were treated with normal saline instead. The concentrations of HIF-1α and VEGF in bronchoalveolar lavagefluid （BALF） were examined using ELISA 24 hours after the last challenge. The pathological changes of lung tissuewere observed by hematoxylin-eosin （HE） staining. The p-mTOR and p-4EBP1 from the lung tissues were detected byimmunohistochemistry and Western blot. Pearson analysis was used to study the correlation between p-mTOR, p-4EBP1,HIF-1α， and VEGF expression. Results Compared with the control group, inflammatory cell infiltration and secretionsin the trachea increased in the asthma group. The levels of HIF-1α and VEGF in BALF and p-mTOR and p-4EBP1expression in lung tissues also increased （P<0.01）。 Compared with the asthma group, inflammatory cell infiltration andsecretions in the trachea were reduced in the two intervention groups, and the levels of HIF-1α and VEGF in BALF andp-mTOR and p-4EBP1 expression in lung tissues were also reduced （P<0.01）。 There were no significant differences inthe above changes between the two intervention groups and control group （P>0.05）。 In the asthma group, there was apairwise positive correlation between lung p-mTOR and p-4EBP1 expression and HIF-1α and VEGF levels in BALF（P<0.05）。 However, there were no correlations in the above indexes in the intervention groups and control group.Conclusions p-mTOR, p-4EBP1, HIF-1α and VEGF together are involved in the pathogenesis of asthma. Rapamycintreatment can block this signaling pathway, suggesting that this pathway can be used as a novel target for asthmatreatment. [Chin J Contemp Pediatr, 2017, 19（1）：104-110]
Key words: Asthma; Mammalian target of rapamycin; Eukaryote initiating factor 4E binding protein 1; Hypoxiainducible factor-1α； Vascular endothelial growth factor; Mice.
哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞及多種細胞因子等共同作用，以氣道慢性炎癥浸潤、氣道重塑及可逆性氣流受限為特征的慢性呼吸系統疾病[1],至今發病機制并不完全清楚。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）是一種高度保守的絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶，由于處于生長調節的中心環節而倍受關注 , 在炎癥損傷、免疫應答及腫瘤等方面發揮重要作用[2-3].研究發現 mTOR 高表達也同樣存在于哮喘中，這可能因為 mTOR 參與了哮喘氣道炎癥浸潤及氣道重塑等病理過程[4],而 mTOR 抑制劑雷帕霉素能阻斷這一過程抑制哮喘的發生，但 mTOR 是如何通過下游靶蛋白參與哮喘的發生少見相關報道。真核生物始動因子 4E 結合蛋白 1（eukaryote initiatingfactor 4E binding protein 1, 4EBP1）是 mTOR 下游的一個重要靶蛋白，激活后可促進包括缺氧誘導因子 -1α（hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在內的調節細胞生長關鍵蛋白的翻譯[5],研究發現 HIF-1α 及 VEGF 在哮喘發生中發揮重要作用[6-8],由此我們推測 mTOR 可能通過激活4EBP1 從而引起 HIF-1α 及 VEGF 表達增加促進哮喘發生，而磷酸化的mTOR、4EBP1（即 p-mTOR、p-4EBP1）被認為是該信號通路激活的標志，本研究通過建立小鼠哮喘模型，檢測肺組織 p-mTOR、p-4EBP1及肺泡灌洗液中HIF-1α、VEGF的表達，從而進一步明確哮喘的發病機制，尋找有效治療哮喘的新方法。
1 材料與方法。
1.1 實驗動物與試劑。
SPF 級 6~8 周齡雌性 Balb/c 小鼠 40 只，體重為18~22 g,由河南省動物實驗中心提供。p-mTOR、p-4EBP1 抗體（美國 Santa Cruz 公司），雷帕霉素、卵清蛋白（OVA）（美國 Sigma 公司）。
1.2 動物模型制備與分組。
[關鍵詞] 哮喘；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；真核生物始動因子 4E 結合蛋白 1;缺氧誘導因子 -1α；血管內皮生長因子；小鼠。
Abstract: Objective To study the expression and significance of the mammalian target of rapamycin （mTOR）/eukaryote initiating factor 4E binding protein 1（4EBP1）/hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α）/vascular endothelialgrowth factor （VEGF） signaling pathway in asthmatic mice. Methods Forty SPF level 6-8 week-old female Balb/C mice were randomly divided into control, asthma, budesonide and mTOR inhibitor （rapamycin） intervention groups（n=10 each）。 The asthmatic mouse model was prepared via OVA induction and challenge test. The intervention groupswere administered with rapamycin at the dosage of 3 mg/kg by an intraperitoneal injection or budesonide suspensionat the dosage of l mg by aerosol inhalation respectively 30 minutes before the OVA challenge. The control and asthmagroups were treated with normal saline instead. The concentrations of HIF-1α and VEGF in bronchoalveolar lavagefluid （BALF） were examined using ELISA 24 hours after the last challenge. The pathological changes of lung tissuewere observed by hematoxylin-eosin （HE） staining. The p-mTOR and p-4EBP1 from the lung tissues were detected byimmunohistochemistry and Western blot. Pearson analysis was used to study the correlation between p-mTOR, p-4EBP1,HIF-1α， and VEGF expression. Results Compared with the control group, inflammatory cell infiltration and secretionsin the trachea increased in the asthma group. The levels of HIF-1α and VEGF in BALF and p-mTOR and p-4EBP1expression in lung tissues also increased （P<0.01）。 Compared with the asthma group, inflammatory cell infiltration andsecretions in the trachea were reduced in the two intervention groups, and the levels of HIF-1α and VEGF in BALF andp-mTOR and p-4EBP1 expression in lung tissues were also reduced （P<0.01）。 There were no significant differences inthe above changes between the two intervention groups and control group （P>0.05）。 In the asthma group, there was apairwise positive correlation between lung p-mTOR and p-4EBP1 expression and HIF-1α and VEGF levels in BALF（P<0.05）。 However, there were no correlations in the above indexes in the intervention groups and control group.Conclusions p-mTOR, p-4EBP1, HIF-1α and VEGF together are involved in the pathogenesis of asthma. Rapamycintreatment can block this signaling pathway, suggesting that this pathway can be used as a novel target for asthmatreatment. [Chin J Contemp Pediatr, 2017, 19（1）：104-110]
Key words: Asthma; Mammalian target of rapamycin; Eukaryote initiating factor 4E binding protein 1; Hypoxiainducible factor-1α； Vascular endothelial growth factor; Mice.
哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞及多種細胞因子等共同作用，以氣道慢性炎癥浸潤、氣道重塑及可逆性氣流受限為特征的慢性呼吸系統疾病[1],至今發病機制并不完全清楚。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）是一種高度保守的絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶，由于處于生長調節的中心環節而倍受關注 , 在炎癥損傷、免疫應答及腫瘤等方面發揮重要作用[2-3].研究發現 mTOR 高表達也同樣存在于哮喘中，這可能因為 mTOR 參與了哮喘氣道炎癥浸潤及氣道重塑等病理過程[4],而 mTOR 抑制劑雷帕霉素能阻斷這一過程抑制哮喘的發生，但 mTOR 是如何通過下游靶蛋白參與哮喘的發生少見相關報道。真核生物始動因子 4E 結合蛋白 1（eukaryote initiatingfactor 4E binding protein 1, 4EBP1）是 mTOR 下游的一個重要靶蛋白，激活后可促進包括缺氧誘導因子 -1α（hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在內的調節細胞生長關鍵蛋白的翻譯[5],研究發現 HIF-1α 及 VEGF 在哮喘發生中發揮重要作用[6-8],由此我們推測 mTOR 可能通過激活4EBP1 從而引起 HIF-1α 及 VEGF 表達增加促進哮喘發生，而磷酸化的mTOR、4EBP1（即 p-mTOR、p-4EBP1）被認為是該信號通路激活的標志，本研究通過建立小鼠哮喘模型，檢測肺組織 p-mTOR、p-4EBP1及肺泡灌洗液中HIF-1α、VEGF的表達，從而進一步明確哮喘的發病機制，尋找有效治療哮喘的新方法。
1 材料與方法。
1.1 實驗動物與試劑。
SPF 級 6~8 周齡雌性 Balb/c 小鼠 40 只，體重為18~22 g,由河南省動物實驗中心提供。p-mTOR、p-4EBP1 抗體（美國 Santa Cruz 公司），雷帕霉素、卵清蛋白（OVA）（美國 Sigma 公司）。
1.2 動物模型制備與分組。
