骨關節炎\\(Osteoarthritis,OA\\)是中老年人的一種常見疾病,慢性起病,造成患者關節疼痛、畸形和功能障礙.已經有研究發現,通過一定大小和頻率的力學刺激來治療骨關節炎,具有明顯緩解癥狀和改善關節功能的作用[1].但是力學治療采用多大的力度和頻率,至今尚無定論,而且治療 OA 的機制也尚未明確.關節軟骨的退變是 OA 發生和發展的重要機制.越來越多的研究表明,軟骨細胞作為關節軟骨的主要組成部分,其凋亡與 OA 的進程關系密切[2].在 OA 患者的關節軟骨中,力學信號可以通過多種途徑調控軟骨細胞的增殖和分化能力.
本研究團隊的前期工作中已經證實,短期內持續的壓力能刺激軟骨細胞增殖,172kPa 的持續壓力下,軟骨細胞的增殖能力最強[3 - 6].但是力學治療不僅講究加壓力度,施壓的頻率對治療效果也有影響.因此在持續性壓力的基礎上進一步研究不同頻率的周期性壓力,對揭示力學方法治療 OA 的機理研究具有重要意義.本研究將持續施加的壓力改進為施加不同頻率的周期性壓力,觀察不同頻率組的軟骨細胞增殖和整合素α1β1分泌的差異,進一步揭示手法治療骨關節炎的機制.
1 材料與方法
1. 1 主要試劑與儀器:胎牛血清\\( GIBCO,美國\\),培養液\\( Hy-clone,美國\\) ,Hank's 液\\( Solarbio,中國\\),雙抗\\( GIBCO,美國\\),0.25% 胰蛋白酶\\( Hyclone,美國\\),Ⅱ型膠原酶\\( Sigma,美國\\),CO2培養箱\\(Thermo,型號:311,美國\\),超凈臺\\(再鑫儀器,VCM -620,中國\\) ,低溫高速臺式離心機\\( Eppendorf,美國\\),熒光倒置相差顯微鏡\\(OLYMPUS,型號:CKX43,日本\\),全自動酶標儀\\(Bio - Tek,型號:ELX900,美國\\) .
1. 2 施加不同頻率的周期性壓力控制裝置:通過前期研究使用的裝置[6],將壓力定為 172kPa,加壓頻率按照分組要求設置B1 組 0. 2Hz,B 兩組 0. 5Hz,B3 組 1Hz,B4 組 2Hz 和 B5 組 5Hz.
1. 3 兔關節軟骨細胞的分離培養與傳代:①取出生時間不到12h 的新生新西蘭兔 2 只,處死;②置于 75% 酒精 100mL 浸泡15min 消毒;③放置在消毒容器里,于超凈臺中進行軟骨分離:剪刀剝離新生兔四肢長骨,剔除干凈肌肉、肌腱和筋膜等軟組織,用手術刀分離四肢骨骺端透明軟骨,并盡量切碎成小于 1m3碎屑;④軟骨細胞消化分離:將切碎軟骨組織放入兩個無菌離心管,每管軟骨體積約為 1mL,加入 4mL\\(4 倍于軟骨體積\\)0.25% 胰蛋白酶,在 37℃ 水浴鍋中消化約 40min,加入 4mL 培養液\\(與胰蛋白酶等體積\\)終止消化,放入低溫高速臺式離心機配平后設定 1500 轉/min,離心 5min,吸除上清液;加入 4mL 濃度為 0. 5mg/mLⅡ型膠原酶進一步消化,37℃ 水浴鍋中消化 4h后,將液體通過 200 目篩網過濾,濾下的液體放入離心管再經低溫高速臺式離心機 1500 轉/min,離心 5min,吸棄上清液,加入培養液重懸細胞,分別接種于 4 個培養皿,培養皿加入含10% 胎牛血清的培養液,放入 37℃ 、5% 二氧化碳及飽和濕度的培養箱中培養.第 2 天原代軟骨細胞貼壁即可換培養液,并于熒光倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況.可見原代軟骨細胞呈小圓、多角等形態,胞漿淡、飽滿,見圖 1.
每天將培養皿在超凈臺中更換培養液一次,注意無菌操作,避免細胞污染.一般于24 -48h 后,顯微鏡下觀察軟骨細胞貼壁情況良好,細胞呈梭形.等長滿培養皿底部 80 - 90% 左右,即可進行消化傳代.傳代使用 1:3 的比例,傳至第三代細胞表型穩定,即可進行實驗見圖 2.
1. 4 各組軟骨細胞增殖的測定:第三代兔軟骨細胞生長狀態良好、表型穩定,用 0. 25% 胰酶消化分離后離心機 1500 轉/min,離心 5min,培養液重懸細胞,調整細胞懸液密度,按 3 × 105個/孔密度接種到 6 孔板,并分為:A 組常規培養不施加壓力,B組 172kPa 壓力以不同頻率干預 2h/d:B1 組頻率 0. 2Hz,B2 組0. 5Hz,B3 組 1Hz,B4 組 2Hz,B5 組 5Hz\\) .干預 3d 后各組按 5× 104密度分別接種到 96 孔板,每組 8 孔,細胞過夜貼壁.第 2天測定細胞增殖:吸棄 96 孔板培養上液,每孔加入 100μL 含10% WST - 1 試劑的培養液,37℃ 孵育 2h 后,450nm 波長測定各孔吸光度 OD 值.根據各孔的吸光度和對照孔的比值分析軟骨細胞的增殖情況.
1. 5 各組軟骨細胞培養上清液中整合素 α1β1 的測定:軟骨細胞培養及傳代同 1. 4,細胞消化分離后按 3 × 105個/孔密度接種到 6 孔板,分組與干預方法同 1. 4.3d 后收集各孔細胞上清液,放入離心管,離心機按照 1500 轉/min,離心 20min,仔細收集上液,采用酶聯免疫吸附法\\(ELISA 法\\)測定各組培養上清液中整合素α1β1 的含量.
1. 6 統計學分析:所有數據以 x珋 ± s 表示,采用 SPSS18. 0 統計軟件對各組間差異進行單因素方差分析,P < 0. 05 為有統計學意義.
2 結 果
2. 1 不同頻率的周期性壓力對兔軟骨細胞增殖的影響:相同大小\\(172kPa\\)不同頻率的周期性壓力干預軟骨細胞 2h/d,作用3d 后,細胞 OD 值對照組 A 組為 1. 08 ± 0. 13,B1 組為 1. 19 ± 0.11,B2 組為 1. 23 ± 0. 08,B3 組為 1. 35 ± 0. 06,B4 組為 1. 45 ± 0.09,B5 組為 1. 37 ± 0. 12.加壓各組與對照組比較 OD 值升高,差異有統計學意義\\(P < 0. 05\\).B 組各組間 OD 值差異也有統計學意義\\(P <0. 05\\),峰值出現在 B4 組.見表 1.
2. 2 不同頻率的周期性壓力對兔軟骨細胞分泌整合素 α1β1的影響:相同大小\\(172kPa\\)不同頻率的周期性壓力干預軟骨細胞 2h/d,作用 3d 后,整合素α1β1 水平對照組 A 組為 3. 02 ± 0.26pg / mL,B1 組為 3. 28 ± 0. 19pg / mL,B2 組為 3. 43 ± 0. 11pg /mL,B3 組為 3. 77 ± 0. 24pg / mL,B4 組為 4. 01 ± 0. 09pg / mL,B5組為 3. 94 ±0. 13pg/mL,周期性加壓各組與對照組比較整合素α1β1 值升高,差異有統計學意義\\(P < 0. 05\\).B 組各組間差異也有統計學意義,峰值出現在 B4 組.見表 1.相同大小\\(172kPa\\)不同頻率的周期性壓力刺激兔軟骨細胞,均能增加軟骨細胞的增殖作用和整合素的含量.其中以2Hz 的頻率作用最強.
3 討 論
OA 是一種慢性、進展性骨關節疾病,發病率很高,給患者和社會帶來重大負擔.目前已得到共識的觀點是,關節軟骨的退變是導致 OA 發生發展的重要機制[7].關節軟骨主要由軟骨細胞和細胞外基質構成.膠原纖維是構成細胞外基質的主要結構,能形成復雜的網格狀結構,將軟骨細胞包裹在內,使關節軟骨能承受壓力、張力及剪切力.軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞類型[8],這些力學刺激通過膠原纖維傳導至軟骨細胞,引起細胞增殖、分化和凋亡等生理變化,最終調節軟骨的退變.
整合素是軟骨細胞的一種膠原受體,由α 和 β 兩個亞單位組成,能夠接受來自細胞外基質傳導到細胞的力學刺激信號.
整合素在力學刺激下與相應的細胞外基質膠原蛋白結合后發生空間結構改變,介導了軟骨細胞與細胞外基質之間的信號通路,它是軟骨細胞力學信號轉導的前提,并進一步調控軟骨的增殖、分化、生長、凋亡甚至影響到細胞外基質的結構[9,10].有研究發現[11],整合素作為最重要的細胞表面力學刺激受體之一,通過細胞外基質 - 整合素 - 細胞骨架信號傳導通路,完成力學刺激的傳導,在防止細胞凋亡、調節細胞基因表達,甚至在腫瘤的侵襲和轉移等生理和病理方面均起著重要的作用[12,13].已知軟骨細胞表達的整合素有:整合素α1β1、α2β1、α3β1、α5β1、α6β1、α10β1、αVβ3、αVβ5 等,正常成人軟骨細胞以 β1型整合素表達為主[11],特別是α1β1、α3β1 和 α5β1,因此 α1β1具有很高的研究價值.
力學方法治療骨關節炎的作用機制離不開生物力學和軟骨細胞研究.軟骨細胞對骨關節炎的產生和發展起著關鍵作用.軟骨細胞的增殖分化與力學刺激有密切關系,整合素就是揭示這種關系的關鍵因子,因此研究力學方法對骨關節炎的作用機制,可以從力學刺激 - 整合素 - 軟骨細胞 - 骨關節炎這條途徑著手.
在前期研究中已經發現,適當的靜水壓力刺激軟骨細胞,能上調Ⅱ型膠原、蛋白多糖和糖氨聚糖等 mRNA 的表達;并且在一定水平內靜水壓越高,軟骨細胞表型越穩定[3,4].周期性力學刺激能促進基質合成,而持續性靜壓力則使基質合成減少[14].Kian[15]對體外培養的軟骨細胞施加 24h 周期性的牽張力,發現Ⅱ型膠原表達上調,同時作為其受體的整合素 α1 與之同步上調,而整合素α5 則只有較小的變化.馬軍利等[16]研究發現一定大小和適宜時間的靜壓力能促進整合素 α2 的表達,持續時間較長、較大的靜壓力則抑制軟骨整合素 α2 的表達.
這些研究涉及到力學刺激的大小和作用時間等參數,但是沒有深入研究力學刺激頻率對軟骨細胞代謝和基因表達的影響.
研究力學方法對骨關節炎治療的機制,必須同時闡明力學大小和刺激頻率對軟骨細胞的影響機制,二者缺一不可.本研究在前期持續性壓力對軟骨細胞作用的實驗基礎上,采用同樣加壓力度、不同頻率的周期性壓力刺激軟骨細胞,研究不同的刺激頻率對軟骨細胞增殖以及整合素表達的影響.結果顯示:
施加 172kPa,刺激頻率分別 0. 2Hz、0. 5Hz、1Hz、2Hz、5Hz 的周期性壓力,均能增加軟骨細胞的增殖作用和整合素α1β1 的含量.其中頻率為 2Hz 的周期性壓力作用最強.說明力學刺激能夠通過上調整合素α1β1,引起基質成分的變化,進一步可以上調軟骨細胞的增殖作用.但并非頻率越高作用越強.本實驗中以 2Hz 頻率的周期性壓力作用最強.這對揭示不同頻率的力學方法對骨關節炎治療效果的機制具有重要意義,并且在臨床治療骨關節炎時,對采取何種推拿手法,使用多大的力度和頻率進行力學方法治療具有指導意義.但是哪種頻率和多大的力度組合能得到最佳治療效果,還有這種組合的力學刺激在力學信號通路方面的研究尚未闡明,這將成為今后研究的重點和趨勢.
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