脊髓損傷\\(Spinal cord injury，SCI\\)是脊柱損傷最嚴重的并發癥，可導致損傷節段以下嚴重的運動、感覺及自主功能障礙，給患者帶來嚴重的身心傷害，也給社會造成巨大的經濟負擔。針對SCI的早期治療與臨床康復已成為當今醫學領域的一大課題。運動訓練作為康復治療的重要手段，廣泛用于SCI患者的臨床康復，其療效也被大量研究所證實。運動訓練促進SCI修復的神經生物學機制仍不十分清楚。
神經生長因子\\(Nerve growth factor，NGF\\)是一種具有神經元營養及促進突起生長雙重生物學功能的多肽因子，對中樞及周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均起著重要作用。本研究在前期建立胸段脊髓打擊損傷大鼠模型基礎上，通過觀察運動訓練對SCI大鼠脊髓內NGF及其酪氨酸激酶受體 A \\(Tyrosine kinase receptor A，TrkA\\)表達的影響，探討運動訓練促進SCI修復的可能機制，為脊髓損傷的康復治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組 健康成年雌性 SD 大鼠24 只，體重\\(225±25\\) g，購自南方醫科大學動物中心。將其隨機分為假手術組\\(n=6\\)、損傷對照組\\(損傷后不訓練，n=9\\)和運動訓練組\\(術后1周開始訓練，共4 周，n=9\\)。
1.2 大鼠 SCI 模型制備 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，切除T10椎板，暴露脊髓。采用通用型脊髓打擊器\\(由中山大學脊髓損傷研究所提供\\)制備脊髓損傷模型。圍手術期肌注青霉素20萬IU/kg預防感染，連續3 d；并定時進行膀胱按摩，協助排便。
1.3 運動訓練 損傷一周后開始運動訓練，每天兩次，每次 10 min，每周連續訓練 5 d，共訓練 4周。減重平板訓練采用專用跑步機及減重裝置。跑臺速度為0.8 km/h。減重量為體重的20%~40% \\(隨時間延長逐漸降低減重程度，第1周減重40%，第2周35%，第 3 周 30%，第 4 周 20%\\)。對照組置于籠內不進行任何康復運動訓練。
1.4 運動功能評定 應用脊髓運動功能行為學評分BBB法觀察SCI大鼠后肢功能恢復情況。完全截癱為0分，正常為21分。得分越高，表明運動功能越好。損傷前及損傷后1、2、3、4、5周分別由兩名熟悉BBB評分標準的研究人員進行盲法評分。
1.5 脊髓標本取材 運動訓練結束后\\(即損傷后5周\\)，10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，4%多聚甲醛磷酸緩沖液灌注固定后，取大鼠T12~L1節段脊髓，經固定、脫水、透明及石蠟包埋。假手術組和損傷對照組均在術后5周取材。
1.6 免疫組織化學檢測 標本經固定后制成5 μm 厚的石蠟切片，按 PV-9000 試劑盒\\(美國 GBI 公司\\)說明進行免疫組織化學二步法染色。光學顯微鏡下觀察切片中組織染色、NGF及TrkA蛋白的表達分布情況。
1.7 Western blot 檢測 取脊髓組織充分研磨后抽提總蛋白，BCA法蛋白定量后，將30 μg蛋白樣本經 10%SDS-PAGE 電泳分離，再轉印至 PVDF 膜上。用含 5%脫脂奶粉的 TBST 封閉 2 h，加入 NGF和 TrkA 一抗 4℃孵育過夜，洗膜，再用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h。ECL化學發光系統檢測蛋白信號。
1.8 統計學方法 采用 SPSSl6.0 統計軟件對數據 進 行 統 計 學 分 析 ，采 用 單 因 素 方 差 分 析 法\\(ANOVE\\)對組間差異進行統計，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結 果
2.1 運動功能檢測結果 運動訓練組和損傷對照組的BBB評分自損傷后第2周開始升高，損傷后第3~5 周時仍呈增加趨勢，運動訓練組較損傷對照組增加更明顯，但兩組BBB評分均低于假手術組，差異有統計學意義\\(P＜0.05\\)。自損傷后第3周\\(即運動訓練兩周\\)起，運動訓練組BBB評分高于損傷對照組，差異有統計學意義\\(P＜0.05\\)，見表1?！颈?】
2.2 NGF 免疫組化檢測結果 NGF 免疫反應陽性產物多分布于脊髓前角的神經元內，脊髓后角及中央管周圍也有出現。運動訓練組NGF陽性染色顆粒明顯增多\\(見圖1\\)，其平均光密度值較假手術組及損傷對照組增加，差異有統計學意義\\(P<0.05\\)，見圖2?！緢D.略】
2.3 TrkA 免疫組化檢測結果 TrkA 免疫反應陽性產物于脊髓前角、后角、中央管周圍處均出現較多分布。運動訓練組TrkA陽性染色顆粒增多見圖3，其平均光密度值較假手術組及損傷對照組增加，差異有統計學意義\\(P<0.05\\)，見圖4。
2.4 Western blot 檢測結果 運動訓練組大鼠脊髓內NGF和TrkA的表達比假手術組及損傷對照組明顯增加，差異有統計學意義\\(P<0.05\\)，見圖5?！緢D.略】
3 討 論
臨床研究表明，恰當的康復運動訓練能夠促進SCI 患者肢體運動和感覺功能的恢復，但其神經生物學分子基礎尚不十分清楚。本研究通過建立SCI大鼠模型，觀察運動訓練對SCI大鼠肢體運動功能的影響。BBB評分是SCI實驗研究中評價脊髓功能的一項重要指標，廣泛應用于SCI大鼠后肢運動功能的評估。本實驗結果顯示，SCI后第1周各組BBB評分均在4分以下，隨著時間的推移BBB評分逐漸增高，在SCI后前2周，對照組、運動訓練組BBB評分并無顯著差異，這與其他學者的研究結果相一致。在SCI 后第 3~5 周時運動訓練組 BBB 評分顯著高于對照組，提示運動訓練可促進SCI大鼠運動功能恢復。
NGF 是神經系統內一類可促進和維持神經元生長、分化并影響突觸可塑性的重要生物活性物質。大量研究已證實，NGF在形態、結構和功能等多方面影響神經元的分化，NGF不僅刺激神經元胞體增大、誘導突起生長并促進樹突發育，調控著神經分化相關功能蛋白的表達與修飾；而且NGF還能夠促進受損中樞神經纖維生長新的軸突，與原來的靶細胞建立新的突觸聯系。體外培養 PC12 細胞發現，加入NGF1~2 d 后 PC12 細胞可延伸出較短的神經突起。
本研究發現，運動訓練組SCI大鼠脊髓內NGF表達較對照組明顯增加，表明運動訓練可促進大鼠脊髓內NGF 表達。提示運動訓練可能通過增加脊髓內 NGF表達來促進受損神經纖維的軸突再生，從而促進SCI大鼠運動功能恢復。
目前認為，NGF所具備的促使成熟神經元重塑的能力，有賴于NGF與其受體TrkA的結合。NGF受 體分為高親和力受體 TrkA 和低親和力受體P75NTR，其中 TrkA 被認為是 NGF 主要的功能受體。
NGF與TrkA結合后，可啟動多種途徑以促進神經元存活。對大鼠皮質注射NGF后，能夠挽救因單眼剝奪誘導皺縮的外側膝狀體核神經元，并加速神經元的生長，這一作用依賴于大鼠皮質內TrkA的活化。NGF誘導的TrkA磷酸化能防止興奮性氨基酸毒性作用引起的細胞凋亡。此外，TrkA不僅啟動促進細胞存活的信號，同時還抑制P75NTR啟動的死亡信號。本實驗發現，運動訓練組大鼠脊髓內TrkA的表達較對照組明顯增加，表明運動訓練可增強損傷脊髓處TrkA 蛋白的表達。其可能機制是 NGF 通過誘導TrkA 磷酸化進而激活 TrkA 通路，從而促進 SCI 大鼠運動功能恢復。提示NGF/TrkA途徑可能參與了運動訓練促進SCI修復過程，可能是康復運動促進SCI修復的重要機制。
綜上所述，本研究顯示運動訓練可增加SCI后脊髓內NGF及其受體TrkA的表達，促進SCI大鼠運動功能恢復。由此推測，運動訓練可能是通過刺激NGF及TrkA的表達增加，激活NGF/TrkA途徑，從而創造出有利于神經再生的微環境，促進脊髓損傷修復。
參 考 文 獻
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