脊髓微血管周細胞（ spinal cord microvascularpericytes,SCMP） 是血-脊髓屏障 （ blood-spinal cordbarrier,BSCB） 的重要組成部分，參與調節脊髓微循環血流、內皮細胞緊密連接和 BSCB 的功能。研究表明 SCMP 的功能變化與多種脊髓疾病相關[1].既往關于中樞神經系統周細胞的體外研究多來源于腦組織，分離策略通常是使用酶消化法獲得微血管片段，在血管片段的基礎上分離培養周細胞，但是此策略容易造成雜細胞的污染。而用免疫磁珠分選和流式分選等方法處理的細胞活性差、產量低，而且成本過高。本研究基于本單位分離腦微血管周細胞的經驗[2],使用商品化的周細胞培養基，通過“培養基篩選法”分離小鼠脊髓微血管周細胞，并對所獲得的周細胞的功能進行評價。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 實驗動物和 細 胞： 清 潔 級 3 周 齡 雄 性C57BL /6 小鼠[中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，許可證號 SCXK（ 京） 2009-0007].所有的實驗方案已獲得中國醫學科院微循環研究實驗動物倫理委員會批準。脊髓微血管內皮細胞（ spinal cord mi-crovascular endothelial cells, SCMECs ） 來 自 本 實驗室[3].

1. 1. 2 主要試劑： 胎牛血清（ FBS） 、改良杜氏伊格爾 培 養 基 （ Dulbecco's modified Eagle medium,DMEM） （ 高糖） 、II 型膠原蛋白酶、雙抗、慶大霉素、谷氨酰胺和 1 × PBS、0. 05% 胰蛋白酶和含 10%FBS 的 DMEM 培養基（ 北京協和醫學院細胞中心） ;含 10% FBS 的內皮細胞培養基（ endothelial cell me-dium,ECM） 和含 2% FBS 周細胞培養基 （ pericytescell medium,PCM） （ Scien Cell 公司） ; 牛血清白蛋白（ BSA） （ Amresco 公司） ; DNA 酶 I（ DNase Ⅰ） 和纖維連接蛋白 Fibronectin（ Sigma 公司） ,膠原蛋白酶/分散 酶 （ Roche 公 司） ; 抗 von Willebrand factor（ vWF） 抗體（ Santa Cruz 公司） ; 抗血小板源生長因子受體（ PDGFRβ） 、神經元-膠質抗原 2（ neuron-gliaantigen 2,NG2） 抗體、von Willebrand 因子（ von Will-ebrand factor,vWF） 抗體、膠質纖維酸性蛋白 （ glialfibrillary acidic protein,GFAP） 抗體和 α-SMA 抗體（ Abcam 公司） ; FITC 標記和 TRITC 標記的二抗（ 北京中衫金橋生物技術有限公司） .APC 標記抗小鼠CD45 抗體、PE 標記抗小鼠 PDGFRβ / CD140b 抗體、PE / Cy7 標記抗小鼠 CD31 抗體、FITC 標記抗小鼠CD11b 抗體及相應的同型對照 （ Biolegend 公司）eFluor\ue5f8 660 標記抗小鼠 GFAP 抗體及相應的同型對照抗體、流式染色緩沖液（ flow cytometry stainingbuffer,FCS Buffer） 、細胞內固定工作液（ intracellularfixation buffer,IC Buffer） 和透化工作液（ permeabili-zation buffer ） （ eBioscience 公司 ） ; 基質膠 （ BD 公司） ; 活細胞熒光示蹤劑 DiI（ 紅色） 和 DiO（ 綠色）（ Life Technologies 公司） .

1. 2 方法

1. 2. 1 細胞分離與培養： 小鼠經 3% 戊巴比妥鈉（ 30 mg/kg） 腹腔注射麻醉，斷頭處死。取出脊髓組織，用濾紙去除軟脊膜，剪碎成約 1 mm × 1 mm ×1 mm大小，整個過程在冰上操作。加入 DMEM、Ⅱ型膠原蛋白酶（ 1 g/L） 、DNase Ⅰ（ 15 mg/L） ,37 ℃消化 1. 5 h.1 000 × g 離心 8 min,棄上清液，20%BSA-DMEM 重懸； 4 ℃ 1 000 × g 離心 20 min.棄上清，加入 DMEM、collagenase/dispase（ 1 g/L） 、DNaseⅠ（ 6. 7 mg/L） ,37 ℃ 消化 1 h.加入 DMEM,700 × g離心 6 min.棄上清，加入含 20% BSA-DMEM 重懸。4 ℃ 1 000 × g 離心 20 min.棄上清后 DMEM重懸，懸液內即含微血管片段。將微血管片段用DMEM 洗 2 次，1000 × g 離心 8 min,700 × g 離心5 min.棄上清重懸后用細胞濾器過濾。用 ECM 將微血管片段接種至兩個 fibronectin（ 10 mg/L） 包被好的 35 mm 培養皿。72 h 后用 PBS 清洗 3 次，以去除漂浮的死細胞以及其他雜質，之后繼續用 ECM 培養。每隔 3 d 換液 1 次，自原代細胞從微血管片段爬出到細胞完全匯合需7 ~9 d.待細胞匯合后用胰蛋白酶消化傳代 2 次，均使用 ECM 進行培養。從第3 次傳代后，用 PCM 培養。取第 5 代細胞用于細胞鑒定實驗（ 圖 1） .

1. 2. 2 細胞鑒定： 1） 倒置顯微鏡觀察 SCMP 的形態： 用倒置顯微鏡每隔 24 h 觀察細胞從微血管片段爬出及增殖狀況并拍照。2） 細胞免疫化學方法鑒定： 待細胞增殖匯合至 75% 左右，對細胞進行固定和透化處理。分別加入一抗（ PDGFRβ、NG2、vWF 和 GFAP） （ 1 ∶ 200 ） ,4 ℃ 孵育過夜； PBS 洗5 min共 3 次； 分別加入熒光標記二抗，室溫下孵育1 h,PBS 洗 5 min 共 3 次； DAPI 染色 5 min,PBS 清洗； 封片。熒光顯微鏡（ DP72,Olympus 公司） 下觀察并拍照，用 Image Pro Plus 7. 0（ IPP） 進行定量分析，實驗重復 3 次。3） 流式細胞術檢測細胞表面蛋白 PDGFRβ、CD11b 和 CD31: 消化并收集細胞，用流式染色工作液將細胞密度調整為 1 × 1010個/ L; 取100 μL 加入流式細胞儀測定管，添加 20 μL Fc 受體阻斷劑，并孵育 10 min; 添加熒光直接標記的流式抗體和相應的同型對照抗體，4 ℃ 避光孵育30 min; 流式染色工作液清洗 2 次后，用 PBS 重懸至 100 μL,用細胞篩制成單細胞懸液，行流式細胞儀檢測。實驗重復 5 次。4） 流式細胞術檢測細胞胞質蛋白 GFAP: 消化并收集細胞，用 FCSB 將細胞密度調整為 1 ×1010個/L; 取 100 μL 加入流式細胞儀測定管，添加 100 μL 細胞內固定工作液，室溫避光孵育30 min; 添加2 mL透化液，400 × g 室溫離心 5 min 后棄上清，用2 mL透化液重懸； 400 × g室溫離心5 min后棄上清； 用 100 μL 透化液重懸，加入相應的抗體或相應的同型對照抗體，室溫避光孵育 30 min; 用 FCSB 清洗 2 次，用 PBS 重懸至100 μL 后用細胞篩制成單細胞懸液，行流式細胞儀檢測。實驗重復 5 次。

1. 2. 3 細胞功能評價： 1 ） 含 10% FBS 的 DMEM培養基對細胞分化標志蛋白表達的影響： ①兩組用 PCM 培養的第 5 代細胞，其中一組改用含 10%FBS 的 DMEM 培養； 另外一組做為對照組繼續用PCM 培養。4 d 后用細胞免疫化學方法和 Westernblot 免疫印記法檢測 α-SMA 的表達。②細胞免疫化學方法鑒定： 對細胞進行固定和透化處理。分別加入一抗 α-SMA 抗體（ 1∶ 200） ,4 ℃ 孵育過夜；PBS 洗 5 min 共 3 次； 加入熒光標記二抗，室溫下孵育 1 h,PBS 洗 5 min 共 3 次； DAPI 染色 5 min,PBS清洗； 封片油封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image Pro Plus 7. 0（ IPP） 進行定量分析，實驗重復 3次。③Western blot 免疫印記法： 將培養至匯合的細胞收集并裂解。以每孔 40 μg 蛋白上樣于 10%SDS-PAGE 分離后，將蛋白轉移至 PVDF 膜上。用抗小鼠 α-SMA 抗體檢測，以 β-actin 為內參。實驗1的比值表示。實驗重復 3 次。2） 基質膠成管實驗：①細胞熒光標記： 脊髓微血管內皮細胞用紅色熒光素 DiI 標記，SCMP 用綠色熒光素 DiO 標記。將培養皿中的培養基吸出，加入染色培養基（ 熒光染料與培養基以 1∶ 200 比例混勻） ,放置培養箱內孵育20 min; 將染色培養基吸出，加入正常培養基清洗 3次（ 每次清洗時用正常培養基孵育 10 min 后再將其吸出） .②以每孔 25 μL 基質膠包被 96 孔板，37 ℃30 min 使膠凝固。將 SCMECs 和 SCMP 以10∶ 1進行混合后進行接種，每孔接種 5 ×103個細胞，ECM 最終體積為 100 μL.24 h 后觀察組成管情況。實驗重復 3 次。

1. 3 統計學分析

數據用均數 ± 標準差（ x ± s） 表示，實驗所用數據采用 SPSS19. 0 軟件處理，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2. 1 倒置相差光學顯微鏡下觀察細胞形態

在內皮細胞培養基中，微血管片段呈典型的串珠狀或分支狀（ 圖 2A） ; 48 h 后，可見細胞從微血管片段中爬出（ 圖 2B） ; 4 d 后，細胞逐漸增多，細胞形態多樣（ 圖 2C） ; 7 ~ 9 d 后細胞匯合（ 圖2D） ; 細胞傳代后（ 第 2 代） 繼續在 ECM 中培養，可見紡錘狀的內皮細胞和多邊形的周細胞呈現伴隨狀增殖（ 圖 2E） ; 傳代后改用 PCM 培養，長梭狀內皮細胞逐漸減少，多邊形、多突起的周細胞呈現優勢增殖（ 圖 2F） .

2. 2 SCMP 的細胞免疫化學和流式細胞術鑒定

對第 5 代的細胞進行免疫熒光染色鑒定，可見細胞 PDGFRβ 和 NG2 雙陽 性 （ 圖 3A ~ C） ;vWF （ 內皮細胞） 和 GFAP （ 星形膠質細胞） 陰性 （ 圖 3D,E） ,表明得到的細胞中沒有內皮細胞和星形膠質細胞的污染。流式細胞儀檢測結果顯示，PDGFRβ 的陽性率為 95. 52% ± 2. 55% ,而 GFAP 為 0. 63% ± 0. 26% ,CD31 （ 內皮細胞）為 0. 80% ± 0. 26% ,CD11b （ 小膠質細胞） 為1. 02% ± 0. 35% （ 圖 4） .

2. 3 10% FBS-DMEM 培養基促進 SCMP 的分化

SCMP 在 PCM 中培養 2 ~ 3 d 即可傳代。細胞保持典型的多角形形態但是體積較小，且 α-SMA 低表達（ 圖 5A） ; 換用 DMEM 培養 4 d 后，α-SMA 的表達明顯上調（ 圖 5B） ,且部分細胞體積增大，Westernblot 結果（ 圖 5C） 表明 α-SMA 的變化情況與細胞免疫化學法檢測結果一致。

2. 4 SCMP 與 SCMECs 聯合培養共同成管

紅色熒光標記的 SCMECs 和綠色熒光標記的SCMP 以 10∶ 1 的比例共培養在基質膠上，24 h 后可以觀察到兩種細胞黏合在一起，共同組成管腔樣結構 （ 圖 6） .

3 討論

有文獻報道使用勻漿研磨結合酶消化分離微血管[4-6],通過振蕩消化使細胞從微血管片段上脫離。但得到的微血管活力差，細胞存活率低，時間和力度難掌控。而采用機械剪切、兩步酶消化結合 20%BSA 離心獲得微血管片段，避免了研磨對微血管的損傷，增加了細胞的生存概率。

通過微血管片段獲取周細胞會面臨雜細胞的污染。從微血管上脫落的既包含內皮細胞和周細胞，也有小膠質細胞和星形膠質細胞。根據本實驗室分離內皮細胞的經驗[7],用 ECM 培養內皮細胞時存在周細胞的污染，而且周細胞會抑制內皮細胞的增殖[8],但 在 ECM 中 膠 質 細 胞 的 生 長 會 受 到 抑制[9-10].因此，先用 ECM 培養微血管，待膠質細胞被抑制后改用 PCM 來抑制內皮細胞。細胞免疫化學和流式細胞術鑒定的結果表明，該方法的內皮細胞和膠質細胞的污染顯著降低。

用 6 ~8 周齡的小鼠分離細胞，從微血管內爬出的細胞數量少，活性低。改用 3 周齡小鼠，則細胞活力強，存活率高。細胞在 25 cm2（ 或更大） 培養瓶中不易生長，而在 35 mm 培養皿中細胞能夠很快形成匯合，生長狀態良好。從而證明中樞神經系統微血管單元的細胞不適合大的生長空間[11].

周細胞是多能干細胞，在體外培養過程中能夠快速分化[12],也有人認為其在傳代過程中能夠保持一定的穩定[13].周細胞常用的標志蛋白為 PDGFRβ 和NG2[14-15],但也有研究表明，周細胞能夠表達一種與血管平滑肌細胞相同的收縮蛋白 α-SMA.體內和新分離的微血管周細胞不表達 α-SMA,而體外培養中周細胞會逐漸表達該蛋白，因此 α-SMA 被認為是一種周細胞分化的標志蛋白[14].本研究發現，PCM中的周細胞體積小，α-SMA 表達低； 換用 DMEM 培養 4 d,部分細胞的體積增大、突觸增多，且 α-SMA表達明顯上調，表明細胞具有一定的分化能力。成管實驗表明，分離的 SCMP 能夠與內皮細胞共同形成管腔樣結構。

綜上所述，本研究建立了一種分離原代 SCMP的方法。具有操作簡單、經濟等優點，可以得到純度高和活力較強的周細胞。

參考文獻：

[1] Winkler EA,Sengillo JD,Bell RD,et al. Blood-spinalcord barrier pericyte reductions contribute to increased cap-illary permeability [J]. J Cereb Blood Flow Metab,2012,32: 1841-1852.

[2]秦偉偉，鹿文葆，劉淑英，等。 大鼠腦微血管周細胞的分離和鑒定[J]. 國際腦血管病雜志，2011,19: 531-534.

[3]苑曉晨，李炳蔚，秦偉偉，等。 大鼠脊髓微血管內皮細胞的分離培養與鑒定[J]. 基礎醫學與臨床，2013,33:1330-1331.

[4]Capetandes A,Gerritsen ME. Simplified methods for con-sistent and selective culture of bovine retinal endothelialcells and pericytes [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990,31: 1738-1744.

[5]Dore-Duffy P. Isolation and characterization of cerebral mi-crovascular pericytes [J]. Methods Mol Med,2003,89:375-382.