甲狀腺相關眼病 （thyroid-associated ophthal-mopathy,TAO） 又稱 Graves 眼病 （Graves ophthal-mopathy,GO）， 是眼眶的炎癥性免疫疾病, 是Graves ?。℅raves disease,GD）最常見的甲狀腺外表現，目前已知引起該病眼球突出等臨床表現主要是由于眶內脂肪組織和眼外肌的膨脹.
過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisomeproliferator-activated receptor, PPAR-γ）在 脂肪化的過程中起到十分重要的作用,分泌卷曲相關蛋白（secreted frizzled-related protein, SFRP）在脂肪組織中的作用也逐漸引起研究人員的重視,且有學者發現，GO 患者眶脂肪組織中 SFRP1 的 mRNA 水平與脂肪量有關. 本研究主要通過檢測 TAO 患者眶脂肪組織中 SFRP、PPAR-γ 的 mRNA 和蛋白的表達情況，初步探索 SFRP 在 TAO 眶脂肪組織增生中的作用。
資料與方法
一、臨床資料
收集我院 2009 年至 2011 年診斷為 TAO 并行鼻內鏡下眶減壓術患者（病變組）眶脂肪組織，共9 例（9 眼），其中男 4 例（4 眼），女 5 例（5 眼），年齡45~73 歲，平均（58.3±9.2）歲。 病例入選標準：①根據臨床癥狀和體征，血三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）及促甲狀腺激素（TSH）檢測，常規眼科檢查及眶部 CT 或磁共振成像（MRI）檢查等，確診為 TAO;②保守治療后效果不佳，突眼、角膜潰瘍及視力受損等未能明顯改善或者視力急劇下降；③期望通過手術改善視力受損和容貌改變等情況的患者。 TAO 的確診依據 Bartley1995 年提出的診斷標準. 有眼瞼退縮者，合并以下之一：①甲狀腺功能異?；蛘{節異常 （包括血清 T3或 T4水平增高，或TSH 降低， 或 T3水平增高抑制和 TSH 釋放激素興奮試驗異常，或血清 TSH 免疫球蛋白陽性）；②眼球突出；③視神經功能障礙；④眼外肌受累。 無眼瞼退縮者， 則必須有甲狀腺功能異?；蛘{節異常，合并有眼球突出或視功能障礙或眼外肌受累之一。
收集我院眼科同期因外傷等原因需要行眼球摘除術或眼外肌矯形術的患者（對照組）術中切除的眶脂肪組織，患者均無甲狀腺疾病史，共 7 例（7 眼），其中男 3 例（3 眼），女 4 例（4 眼），年齡 38~65 歲，平均（53.1±12.5）歲。
二、方法
1. 實 時熒光定量 PCR 檢 測 眶 脂 肪 組 織 中SFRP1~5 及 PPAR-γ 的 mRNA 水平：用 Trizol 法提取組織中總 RNA,紫外分光光度計上定量，RNA 純度為 A260/A280= 1.8~2.0. 用寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）反轉錄試劑盒反轉錄 1 μg 總 RNA,去基因組 DNA 反應條件為 42℃、2 min,4℃驟冷；反轉錄反應條件為 37℃ 15 min,85℃ 5 s.實時熒光定量 PCR 目的基因及內參基因引物均由 Primerpremier 5.0 軟件跨內含子設計，由上海生工生物工程公司合成， 序列詳見表 1. 樣本實時熒光定量PCR 反應均做復孔， 條件為預變性 95℃ 30 s;95℃變性 5 s,60℃退火延伸 30 s, 共進行 40 個循環；采用 2-ΔΔCT值對組間目的基因的相對表達量進行比較?！颈?】
2. 蛋白質印跡（Western blot）技術檢測眶脂肪組織中 SFRP2 以及 PPAR-γ 的蛋白表達情況：采用蛋白裂解液 RIPA （上海申能博彩生物有限科技公司）抽提組織蛋白，考馬斯亮蘭法測定組織蛋白濃度， 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉膜，5%脫脂奶粉封閉后加一抗過夜。 洗去一抗后加入二抗孵育 1 h, 洗滌后電化學發光法（ECL）顯 色 . 內參對照采用肌動蛋白 （actin）。 抗SFRP2 和 抗 PPAR-γ 兔 抗人單克隆抗體及二抗均購自美國圣克魯斯生物技術公司。
三、統計學方法
所有數據采用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析。實驗數據用x±s表示。 2 組間均數比較采用 t 檢驗。以 P<0.05 為差異具有統計學意義。
結 果
一、SFRP1~5 和 PPAR-γ 的 mRNA 表達
TAO 病變組眶脂肪組織中 SFRP2 的表達水平高于對照組， 差異具有統計學意義 （P<0.05），而SFRP1、SFRP3、SFRP4、SFRP5 在 2 組 間的差異無統計學意義（P>0.05）。 在 TAO 病變組眶脂肪組織中 PPAR-γ 的 mRNA 表達水平高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.01）（見表 2）?！颈?】
二、SFRP2 和 PPAR-γ 的蛋白表達
TAO 患 者 眶 脂 肪 組 織 中 SFRP2 及 PPAR-γ的蛋白水平均較對照組明顯升高（見圖 1），分別為0.96±0.77 比 0.03 ±0.05 和 0.90 ±0.51 比 0.14 ±0.15（均 P<0.01），2 組間 SFRP1、SFRP3、SFRP4 和SFRP5蛋白水平均無差異（P>0.05）?！緢D1】
討 論
TAO 是一種免疫性疾病，免疫機制的異常導致局部炎癥的發生，引起眶內脂肪和眼外肌的腫脹.眼眶脂肪組織在 TAO 的發病中起重要作用， 其增多導致眶壓增高，眼球突出，同時脂肪組織本身分泌的多種脂肪細胞因子、生長因子等也可能參與了TAO 的發病。脂肪細胞分化是指成纖維細胞樣的脂肪前體細胞在一系列細胞內、外因素作用下轉變為成熟的、充滿脂質的脂肪細胞的過程。
首先， 本研究結果顯示在 TAO 病變組眶脂肪組織中 PPAR-γ 的 mRNA 和蛋白表達水平均明顯高于對照組。 PPAR-γ 是脂肪細胞分化中起重要作用的因子之一， 有學者研究指出 TAO 患者眶內脂肪基質細胞在 PPAR-γ 水平上調后能向脂肪細胞分化. 說明 PPAR-γ 表達水平的上調在 TAO 眶脂肪增生過程中具有一定的作用。 其次，本研究結果顯示 SFRP 家族中 SFRP2 在 TAO 病變組眶脂肪組織中的 mRNA 和蛋白表達水平也均明顯高于對照組。 那么，SFRP2 可能通過怎樣的信號轉導通路影響 PPAR-γ 的上調，進而引起眶脂肪增生的呢？
研究認為，Wnt 信號途徑是脂肪分化過程中起重要作用的一條信號通路. Wnt 蛋白與其特異性受體及輔助受體結合后，啟動一系列下游信號分子的磷酸化和去磷酸化，完成其信號轉導過程，并對脂肪形成起到抑制作用。 經典 Wnt 信號途徑亦稱Wnt/β 聯蛋白（β-catenin）信號途徑。在此信號轉導過程中，Wnt 蛋白與其特異性受體卷曲蛋白（frizzled,Fz） 及 輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白 5/6（LRP5/6）結 合后 ,激活 dishevlled（Dvl） 蛋 白 ,使糖原合成酶激酶 3β（GSK-3β）、結腸腺瘤樣息肉（APC）腫瘤抑制因子和細胞支架蛋白（axin）形成的蛋白三體復合物的活性受到抑制，導致內源性 β 聯蛋白在細胞質中積聚并進入細胞核，β 聯蛋白可以通過直接抑制 PPAR-γ 和 CCAAT 增強子結合蛋白（C/EBP）α的表達來維持脂肪前體細胞的未分化狀態. 而SFRP 作為 Wnt 信號途徑的抑制劑，其結構與 Fz 受體極為相似，具有同源的配體抑制區，通過競爭性結合 Wnt 蛋白而抑制 Wnt 的活動,從而可能增強PPAR-γ 的表達水平，促進了脂肪細胞的分化，導致脂肪組織的增生。 其中 SFRP2 又名分泌型凋亡相關蛋白 1（secreted apoptosis-related protein 1,SARP1），位于 4 號染色體 q31-3.全長約 2 kb,編碼一個大小約 34 ku 的可溶性蛋白質，表達于胞漿，但也可分泌至胞外發揮作用。 另有研究表明，SFRP2 能穩定β 聯蛋白，受甲狀腺激素上調作用，經過激活 β 聯蛋白信號通路，作用于 Fz 受體，能加強細胞增殖.
因此，SFRP2 作為 SFRP 家族成員， 不僅可以通過競爭性抑制 Fz 受體而抑制 Wnt 的活動， 促進脂肪細胞分化導致脂肪組織的增生，而且在甲狀腺激素上調的 TAO 患者中，SFRP2 還可能通過加強眶脂肪細胞的增殖來增加眶脂肪的體積。Kumar 等研究發現 TAO 患者眶脂肪組織中SFRP1 及 PPAR-γ 的基因表達水平 均高于正常對照組， 認為 SFRP1 在 TAO 患者的發病中可能起到一定的作用。 本研究結果與其有所不同，可能是樣本量或者實驗檢測手段的不同等原因導致，進一步的研究可利用基因轉染或干擾技術上調或下調眶內前脂肪細胞中 SFRP 的表達來觀察其分化情況，對 SFRP 在 TAO 發病中的作用進行更深入的探索。
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